药用石斛及其混伪品的DNA 条形码分子鉴定*

徐素素，高 静，陈军文，赫京生，刘祥宇，张敬丽

(1.云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 西南中药材种质创新与利用国家地方联合工程研究中心，云南 昆明 650201；3.云南农业大学 云南省药用植物生物学重点试验室，云南 昆明 650201；4.云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650201)

石斛属(DendrobiumSw.)植物为兰科(Orchidaceae)附生草本，中国有76种，主要分布在华南及西南地区，其中可作药用的有40 余种[1]。现代药理学研究表明：石斛富含多糖、生物碱和香豆素等化学成分，具有抗衰老、抑制肿瘤和降血糖等功效[2-5]。由于石斛属植物集观赏和药用价值于一体，市场需求量大，无节制的采摘导致野生石斛资源匮乏甚至灭绝[6-7]。此外，石斛属植物近缘种间形态特征十分相似，石斛药材中常混有金石斛属、石仙桃属和石豆兰属的某些物种[8]。石斛具有益胃生津和滋阴清热等功效，用于治疗热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软[9]；而石仙桃具有养阴清肺和利湿消瘀等功效，用于治疗眩晕，头痛，咳嗽，吐血，梦遗，痢疾，白带，疳积[10]。可见，石斛与石仙桃的主治功能截然不同，而且干燥后的石斛药材仅凭传统形态学鉴定更加困难。为了保证药用石斛的临床疗效和安全应用，亟须一种简单、高效的鉴定方法对其进行准确的鉴定。

传统的鉴定方法难以完全实现对中药材的准确鉴定。DNA 条形码(DNA barcoding)是一种分子诊断技术，于2003 年由加拿大大学的HEBERT教授首次提出[11]，主要利用基因组中1 段公认标准的、相对较短的DNA 片段，对不同物种进行快速、准确地识别和鉴定。DNA 条形码技术简单、快速和高效，避免了主观和客观等因素，被认为是物种鉴定及系统进化分析的有效手段[12-16]。目前，国际上公认的植物DNA 条形码候选序列主要有ITS、ITS2、psbA-trnH、matK 和rbcL[17]。《中国药典》2015 年版收载DNA 条形码技术指导原则建立了植物类采用ITS2/ITS 为主、叶绿体psbA-trnH 为辅的中药材鉴定体系。CHEN等[15,18]首次建立了以ITS2 为核心、psbA-trnH 为辅的植物类药材的DNA 条形码鉴定体系，并提出以ITS2 序列作为植物通用DNA 条形码，极大提升了中药材鉴定能力。

DNA 条形码技术在石斛属中的应用越来越广泛[19]。相关研究利用DNA 条形码技术已成功区分多个石斛属物种[20-22]。本研究以金钗石斛(D.nobile)、流苏石斛(D.fimbriatum)和密花石斛(D.densiflorum)等12种药用石斛共82 个样品为研究材料，以核基因片段ITS 和ITS2 序列以及叶绿体基因片段psbA-trnH 和matK 序列为研究对象，并从GenBank 数据库中下载44 条相关石斛及混伪品序列，以期寻找最适于药用石斛及其混伪品高效准确的鉴定方法，为药用石斛的临床疗效和安全应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究用于DNA 条形码分析的82 份药用石斛材料均来自云南野兰堂生物科技有限公司兰科植物种质资源圃，样品主要采自云南、广西、海南和四川等省的野外并且来自多个居群，所有样品均由云南农业大学中药材研究所和中国科学院昆明植物研究所相关专家进行鉴定(表1)，凭证标本保留在云南农业大学云南省药用植物生物学重点实验室。所选12种石斛在分布范围上属于狭域分布，参考高连明等[23]关于DNA 条形码采集规范，建议狭域分布物种样本数量需采集5种以上，故本研究对每种植株随机采集5～7 株植物个体的当年生新鲜叶片，能够代表所采物种整个分布区的不同居群的遗传多样性。用75%的乙醇清洗叶片表面，并正确标记采样名称及采样编号，然后用硅胶快速干燥放入-80 ℃冰箱低温保存。从GenBank 数据库中下载相关石斛种及混伪品的序列44 条(表2)用于后续分析。

表1 石斛属植物样本采集信息Tab.1 Sample information of Dendrobium species

表2 从GenBank 中下载序列信息Tab.2 The information of sequences downloaded from GenBank

1.2 植物基因组DNA的提取

在研钵中放入0.2 g 石斛新鲜叶片，加入液氮冷冻，快速将叶片研磨成粉，参考李金璐等[24]改良的CTAB 法进行总DNA的提取，并长期保存在-20 ℃冰箱，防止DNA 发生降解。

通用引物和PCR 反应条件参考CHEN 等[15]的研究，通用引物在擎科生物科技有限公司昆明分部合成。ITS、ITS2、psbA-trnH 及matK 扩增引物见表3。PCR 扩增体系总体积为25 μL：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，DNA 模板2 μL，正、反向引物各1 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增完成后，用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行检测。将扩增成的PCR 产物送至擎科生物科技有限公司，进行双向测序。

表3 序列引物Tab.3 The sequence primers

1.3 数据处理

通过序列拼接软件Seq Man 对试验获得的双向测序结果进行校对拼接，去除低质量序列及引物区。基于隐马尔科夫模型(HMMer)的注释方法[25]，去除5.8S 和28S 区段获得ITS2 间隔区序列。使用MEGA 7.0 (molecular evolutionary genetics analysis)软件进行序列特征、DNA 条形码序列间隔(barcoding gap)和系统发育分析；利用Edit seq 软件对4 条序列进行组合，基于Kimura 2-parameter (K2P)模型计算种内和种间遗传距离及构建NJ 系统发育树，用自举检验法(bootstrap test)检验系统各分支的置信度，共循环1 000次，支持率仅展示≥60%的数值。

2 结果与分析

2.1 总DNA 提取、PCR 扩增及测序

对提取的82 个样品的总DNA 进行检测，DNA 条带均明亮且清晰；利用4 对通用引物对总DNA 片段进行PCR 扩增，扩增产物均呈现整齐、单一明亮的条带，4 条序列的扩增成功率均为100% (图1)。测序结果表明：大多数序列的检测结果较为理想，峰图清晰、基线平整；ITS 与ITS2 序列测序成功率最高为97.6%，其次是matK序列为96.3%，psbA-trnH 序列最低为95.1%；4 条序列的测序成功率都高达95%以上，均可用于后续试验数据分析。

图1 部分样品PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis with PCR amplification of some samples

2.2 序列特征分析

由表4 可知：用于分析的ITS 序列有93 条、ITS2 序列91 条、psbA-trnH 序列93 条和matK 序列82 条，其中包括从GenBank 数据库中下载的11 条ITS 序列、11 条ITS2 序列和9 条psbA-trnH序列。比对后的序列长度为matK＞psbA-trnH＞ITS＞ITS2，均小于1 000 bp，满足理想的DNA 条形码长度的要求。GC 平均含量为ITS＞ITS2＞psbA-trnH＞matK，其中ITS 和ITS2 序列的GC 含量与psbA-trnH 和matK的GC 含量差异较大。ITS2 序列的变异位点最多，占总位点数的65.6%；ITS 序列变异位点占总位点数的58.9%；psbAtrnH 序列变异位点占总位点数的14.9%；matK 序列的变异位点最少，仅占总位点数的11.5%。

表4 4 条序列在12种药用石斛中的序列特征Tab.4 The sequence characteristics of four sequences in medicinal Dendrobium species

2.3 DNA 条形码序列间隔分析

由图2 可知：4 条序列的平均遗传距离为ITS2＞ITS＞psbA-trnH＞matK，数值分别为0.238、0.180、0.031 和0.019；种内平均遗传距离ITS2＞ITS＞psbA-trnH=matK，数值分别为0.009、0.007、0.001 和0.001；种间平均遗传距离为ITS2＞ITS＞psbA-trnH＞matK，数值分别为0.260、0.195、0.036和0.021。经过比对可知：ITS2 序列的变异性最大，matK 和psbA-trnH 序列较保守，ITS 序列与ITS2 序列的平均种内种间遗传距离趋势大致相同并且重叠较少，因此，ITS 和ITS2 序列被认为具有理想DNA 条形码的特征。

图2 4 条序列的条形码序列间隔图Fig.2 The barcoding gap diagram of four sequences

2.4 系统发育分析

由图3 可知：ITS 和ITS2 序列将系统发育树分为13 支，将12种药用石斛及混伪品区分开，并且具有较高支持度，可靠性高；psbA-trnH 序列将系统发育树分为9 支，只区分出9种石斛，未能把石斛组的叠鞘石斛、双斑叠鞘石斛和流苏石斛及混伪品区分开；matK 序列将系统发育树分为11 支，将10种药用石斛及混伪品区分开，未能把石斛组的叠鞘石斛和流苏石斛区分开。由图4 可知：4 条序列联合构建的系统发育树与ITS和ITS2 单序列构建的系统发育树分支相似，但是支持度较高。因此，ITS 和ITS2 序列对药用石斛的鉴定效果优于psbA-trnH 和matK 序列。

图3 基于ITS、ITS2、psbA-trnH 和matK 单序列构建的NJ 系统发育树Fig.3 NJ phylogenetic tree based on ITS,ITS2,psbA-trnH and matK sequences

图4 多序列联合构建NJ 系统发育树Fig.4 Construction of NJ phylogenetic tree by multiple sequences.

3 讨论

3.1 石斛属植物DNA的提取、PCR 扩增及测序

PCR 扩增及测序成功率是评价DNA 条形码技术实用性及通用性的指标。本研究中，4 条候选序列(ITS、ITS2、psbA-trnH 和matK)扩增成功率均为100%，其中ITS 和ITS2 测序成功率都为97.6%，其次是matK 为96.3%，psbA-trnH 相对较低，为95.1%；但是4 条序列的测序成功率都高达95%以上。前人研究显示：ITS 和ITS2序列在山茶属和委陵菜属植物中很难扩增或者测序成功[26-27]，ITS 序列在鸡血藤植物中测序成功率较低[28]，本研究中4 条序列利用通用引物进行扩增及测序成功率都很高，说明ITS、ITS2、psbA-trnH 和matK 序列在石斛属中比较容易获得。

3.2 序列间隔评估

序列间隔是探究某一序列作为理想条形码的重要依据，物种的种内与种间遗传距离应该有足够的间隔区。本研究基于4 条序列构建的序列间隔图中，ITS 序列与ITS2 序列的种内种间遗传距离趋势大致相同，ITS 和ITS2 序列在供试材料种内和种间比psbA-trnH 和matK 序列存在的重叠部分少，具有序列间隔，更倾向于理想的DNA条形码。黄海[29]对石斛属植物DNA 条形码序列的筛选发现ITS 序列具有明显的序列间隔；张忠廉等[30]对千斤拔属药用植物DNA 条形码鉴定研究中发现ITS2 序列在序列间隔检验中具有显著间隔，与本研究结果一致。综上所述，ITS 和ITS2序列可以作为药用石斛鉴定的候选DNA 条形码序列。

3.3 DNA 条形码的筛选及物种鉴定

DNA 条形码的关键作用是能够对不同物种进行快速准确的鉴定，前人对石斛属植物条形码进行了大量研究工作。王晖等[31]选择rbcL、matK 及ITS2 序列探讨石斛属植物发育关系发现：ITS2 序列不仅具有最大的种内和种间遗传变异，而且有明显的序列间隔，分支支持率也最高。王晖等[31]和NGUYEN 等[32]研究表明：在石斛属植物中ITS 和ITS2 序列鉴定能力最强。在本研究中，ITS 和ITS2 序列的变异度与种间和种内遗传距离范围均大于psbA-trnH 和matK 序列，序列间隔重叠少，并且能够成功区分来自9 个组的12种药用石斛及其混伪品；基于psbA-trnH和matK 序列构建的系统发育树中，除了石斛组的4种石斛分布较散乱，没有聚在1 个大支上，其余均能区分开，证明psbA-trnH 和matK 序列也具有一定的鉴别能力；通过多序列联合构建的系统发育树除分支支持度较高外，分类与ITS 和ITS2 单序列构建的系统发育树相似。

栗丹等[33]利用ITS 序列对石斛进行鉴定，将传统分组中不在石斛组的重唇石斛、钩状石斛、鼓槌石斛和叉唇石斛分在了石斛组；李海霞[34]对石斛属66 条ITS 序列以及外群密花石豆兰和云南石仙桃构建NJ 系统发育树发现有6 个物种与传统分类方法不一致；本研究中石斛组的金钗石斛和瘦轴组的钩状石斛始终聚为1 个分支，说明传统的形态学鉴定与分子生物学鉴定存在一定的差异。因此，不同物种分类鉴定时，分子生物学鉴定需要传统鉴定方法加以辅助，才能达到对物种精确鉴定的目的。

CHEN 等[15]通过大量的研究提出将ITS2 作为药用植物鉴定的通用条形码序列，中国植物DNA 条形码研究组也建议将ITS/ITS2 序列作为种子植物的核心条形码[35]，后续也有较多相关研究表明ITS 或ITS2 序列有较强的鉴别能力[36-40]。从本研究构建的系统发育树分析表明：ITS 和ITS2 序列在12种药用石斛及混伪品中的物种鉴定效率高于psbA-trnH 和matK 序列；通过多序列联合构建的系统发育树进一步验证了ITS 和ITS2 单序列建树的准确性，也证明matK 和psbA-trnH 序列能够提高对石斛属植物的鉴别能力。但是，DNA 条形码技术也存在一定的局限性，对于存储时间过长或加工过的药材鉴定困难，也无法对天然矿物类的药材进行鉴定[41-42]。另外，DNA 条形码技术只能鉴别药材真伪，无法进行药材质量评价[43]。至今未找到可以对所有生物进行鉴定的通用序列，因此，DNA 条形码鉴定体系的完善需要多条序列联合应用。

4 结论

ITS 和ITS2 测序成功率高于matK 和psbAtrnH 序列，且ITS 和ITS2 序列种内和种间存在重叠的部分较少，具有序列间隔；ITS 和ITS2 序列能够成功区分所研究的12种药用石斛及混伪品，psbA-trnH 和matK 序列未能把全部石斛区分开；4 条序列联合构建的系统发育树与ITS 和ITS2 单序列构建的系统发育树相似。因此，以ITS 和ITS2 序列为主、psbA-trnH 和matK 序列为辅的DNA 条形码鉴定方法能够对药用石斛及其混伪品进行快速准确的鉴定。