丁香精油与茶多酚复合抗菌液的抑菌活性协同作用及抗氧化活性

都津铭，张萍，高德*

（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州 310058）（2.浙大宁波理工学院机电与能源工程学院，浙江宁波 315100）

鱼产品是人类饮食中重要的蛋白质来源，随着人们对食品品质和安全要求的提高，保持其新鲜度和货架期已成为当前亟待解决的问题。微生物腐败[1]和脂质的氧化变化[2]是鱼产品腐败的最主要两种机制，因此开发具有高效抑菌能力和抗氧化性的抗菌剂是鱼类保鲜的主要研究方向。丁香精油（Essential Oils，EO）是植物次生代谢产物中对鱼类腐败菌的抑制效果最佳的一种精油[3]，具有高效的抑菌活性[4]。赵冉冉等[5]研究发现丁香精油对青霉和灰霉的生长抑制时间可达9 d和8 d。但单一的精油种类在鱼产品的实际应用中很少能起到理想的保鲜效果[6]，而且对于不同的革兰氏阴性菌（大肠杆菌、沙门氏菌和铜绿假单胞菌）和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、粪肠球菌和单增李斯特氏菌），精油对铜绿假单胞菌的抑制作用相对最低[7]。因此将EO与其他天然抗菌剂进行复合，制备高效、广谱的天然复合抗菌剂具有更大的研究价值。如Hafsa等[8]研究发现桉树精油与壳聚糖的复合涂层对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌有更好的抗菌活性，而且可以显著提高纯壳聚糖涂层的抗氧化性。黄洒等[9]研究发现不同的精油之间对金黄色葡萄球菌均有协同作用。

茶多酚（Tea polyphenols，TP）是茶叶中多羟基酚类化合物的复合物，具有显著的抗氧化活性[10]，是一种天然酚类抗氧化剂，且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有显著的抑菌效果[11]，因此是鱼类抗菌保鲜领域的良好抗菌剂。蓝蔚青等[12]研究发现茶多酚具有较强的抗氧化作用。而且茶多酚的抗氧化性高于维生素C[13]。已有研究表明茶多酚与其他天然抗菌剂进行复合，可以起到协同抑菌、抗氧化作用。如Li等[14]研究的天然防腐剂茶多酚（TP）与壳聚糖复合使用可以发挥出协同作用，比对照组延长红姑鱼片6～8 d的货架期。唐煜括等[15]从茶多酚与维生素C的混合物中得出2:1的时候对大肠杆菌的协同作用最强。这些研究为TP与其他天然抗菌剂的复配提供了良好的参考。

目前国内外许多研究主要集中在不同精油之间[16]、精油与其他抗菌剂[17,18]、茶多酚与其他抗菌剂[19]的组合的抑菌协同作用，而对EO和TP这两者兼具抗菌性和抗氧化性的天然抗菌剂之间的复合液对鱼类特征腐败菌[20]的抑制效果研究还鲜有报道。本文通过制备一系列丁香精油和茶多酚的复合抗菌剂，考察了丁香精油与茶多酚两者质量比对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的协同抑菌作用及最佳抑菌浓度的复合抗菌液对鱼类特征腐败菌的抑菌效果，并对其抗氧化性进行了研究，为开发对抑制鱼类特征腐败菌效果良好的复合天然抗菌液和鱼产品保鲜应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

丁香精油（分析纯，≥80%）购自上海麦克林生化科技有限公司；茶多酚（97%）购自上海麦克林生化科技有限公司；氯化钠（分析纯）购自上海麦克林生化科技有限公司；大肠杆菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC25923、铜绿假单胞菌ATCC9027、副溶血性弧菌ATCC17802均购自上海鲁微科技有限公司；肉汤琼脂培养基（分析纯）购自杭州微生物试剂有限公司；2,2-联苯基-1-苦肼基（分析纯）购自上海易恩化学技术有限公司；无水乙醇（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

AL104型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；US-300T型超声波均化器，上海生析超声仪器有限公司；LRH-250F型生化培养箱，上海慧泰仪器制造有限公司；BGLL-230BE型电热鼓风干燥箱，上海本亭仪器有限公司；SPH-211B型标准型大容量恒温培养摇床，上海世平实验设备有限公司；LDZX-50L型立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 复合抗菌液的制备

茶多酚溶液浓度的配制：将1.5 g茶多酚溶于水中定容至50 g，密封磁力搅拌30 min，制成3%的茶多酚溶液，再用无菌蒸馏水稀释成质量浓度为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%的溶液。

丁香精油浓度的配制：先将丁香精油用无水乙醇按质量比1:2溶解，再按所需的浓度用水具体稀释成质量浓度为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%的溶液。

复合抗菌液浓度的配制：按m(EO)：m(TP)=1：1、1：2、2：1配制总质量浓度为0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%的复合抗菌液。

1.3.2 菌悬液的配制

采用麦氏比浊法[21]，将斜面菌种接种于LB培养基中，37 ℃恒温振荡培养箱中活化24 h，接种在LB琼脂平板上，平板划线后倒置与37 ℃恒温培养箱中培养过夜，挑取典型菌落加入培养基中，并依次做10倍递增稀释，将菌悬液稀释至比色浊度，配制成菌液浓度为100～300 cfu/mL左右的稀释液作为试验用菌液。

1.3.3 最小抑菌浓度的测定

采用二倍稀释法[22]测定茶多酚、精油及其混合物[m(EO)：m(TP)=1：1、1：2、2：1]的 最 小 抑 菌 浓 度（minimum inhibitory concentration，MIC）。取26支灭菌试管并编号，纯精油抗菌液记为E，纯茶多酚抗菌液记为T，不同质量百分比的丁香精油/茶多酚复合抗菌液分别记为E/T（1：1）、2E/T（1：2）、E/2T（2：1）。将1.6%的E、T、E/T、E/2T、2E/T各1 mL加入试管中，然后分别加入1 mL液体培养基中，顺序对应分别记为E-1.6、T-1.6、E/T-1.6、E/2T-1.6、2E/T-1.6，混合均匀；从E-1.6号试管中吸取1 mL混合溶液加入E-0.8号试管，再加入等体积的液体培养基，混合均匀，以此类推二倍梯度稀释四次，在最后编号的试管中加入1 mL灭菌生理盐水和等体积的液体培养基，作为空白对照。其它抗菌液组重复上述操作。在所有试管中分别加入200 μL活化菌悬液，塞上棉塞，在37 ℃培养16 h，观察试管中是否变浑浊，若变浑浊则表明有菌落形成，从没有明显菌落生长的试管中吸取200 μL液体，涂布在平板培养基上培养24 h，观察是否有菌落长出，确定样品溶液MIC。每组实验设2个重复，取平均值。

1.3.4 协同效应试验

根据MIC实验结果确定的最小抑菌浓度，以纯精油和茶多酚抗菌液为对照组，将复合抗菌液（E/T、E/2T、2E/T）作为实验组。分别向4.5 mL的不同抗菌液中加入0.5 mL菌悬液，搅拌2 min，混合均匀，然后每组吸取0.5 mL注入到琼脂LB培养基中，于37 ℃生化培养箱中培养14 h，计算活菌落数，每种抗菌液平行做三组求平均。各抗菌液成分配比表如表1。

表1 抗菌液成分配比表Table 1 Composition ratio table of antimicrobial solution

1.3.5 抑菌圈试验

按m(EO):m(TP)=2:1配制总质量浓度分别为0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的的复合抗菌液，分别记为2E/T-0.4、2E/T-0.6、2E/T-0.8、2E/T-1.0。

改进了Kalemba[24]的抑菌圈法，将25 g LB液体培养基粉末和15 g琼脂LB固体培养基粉末分别加到蒸馏水中定容至1 L，然后分装于锥形瓶中，置于高温灭菌锅中，高温灭菌30 min，冷却到45 ℃后将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和副溶血性弧菌放入LB液体培养液中进行活化培养，于37 ℃摇床中培养24 h，另外将固体培养基置于45 ℃恒温箱内备用。

向各培养皿内注入15 mL～20 mL的固体培养基（约45 ℃），然后取活化好的菌悬液等量加入培养皿中，待其冷却凝固。

用滤纸（直径15 mm）浸泡不同浓度的复合抗菌液，滤掉多余的液体，然后放在培养基表面，然后放置在恒温（37 ℃）摇床中培养12 h。最后用十字交叉法观察透明抑菌圈直径，并用游标卡尺记录，每组各做3个平行样最后取平均。

判定标准：抑菌圈大小与滤纸直径的差>9 mm（极度敏感）；7～9 mm（高度敏感）；4～6 mm（中度敏感）；1～3 mm（低度敏感）；<1 mm（不敏感），抑菌圈直径与抑菌活性成正比。

1.3.6 抑菌持久性试验

选用最小抑制浓度的复合抗菌液探究其抑菌持久性，用抑菌圈法将该复合抗菌液分别用滤纸片法贴于培养基表面，观察每天不同特征菌的抑菌圈大小变化。

1.3.7 抗氧化性试验

老福没把这个消息告诉母亲，怕她受刺激血压升高影响健康，母亲问他找到小宋没有，他含糊地回答说还没有，会找到的，让母亲放心。晚上他睡不着，烟缸里堆满了烟头，屋里的烟味呛得他自己都睁不开眼睛。

1.3.7.1 DPPH自由基清除率的测定

参考符群等[25]的方法，略有改动。配制质量浓度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%及1%的2E/T复合抗菌液。配制0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，量取3 mL于试管中，加入1 mL不同配比的复合抗菌液，立即混匀，于室温条件下避光放置30 min，在517 nm波长下测定吸光值Ai；取3 mL无水乙醇和1 mL不同配比的复合抗菌液混合于室温条件下避光放置30 min，于517 nm波长下测定吸光值Aj；以无水乙醇代替复合抗菌液，加入3 mL DPPH无水乙醇测定吸光值A0，每组平行3次。DPPH自由基清除率（K）的计算公式如下：

1.3.7.2 ABTS自由基清除率的测定

参考孙世利等[26]的方法略有改动，配制终浓度为7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L过硫酸钾的混合液，室温避光条件下静置过夜（12 h），制得ABTS自由基储存液，使用时用75%乙醇稀释至734 nm处吸光度为0.70（±0.05）的应用液。0.1 mL样品待测液加入3.9 mL ABTS应用液，充分混合后置于室温下避光反应6 min后测定其在734 nm处的吸光度（10 min内吸光度稳定），以蒸馏水代替样品液作为空白对照。每组平行3次。

ABTS自由基清除率/%=[(A对照-A样品)/A对照]×100%

1.3.8 数据处理

数据结果采用SPSS 26进行方差分析，显著性取p<0.05。采用Microsoft Excel 2016作图，所有的数据均至少重复3次进行，结果以平均值±标准差进行表示。

2 结果与讨论

2.1 不同抗菌液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度

不同抗菌液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度实验结果如表2和3所示。由表2可知，纯精油组对大肠杆菌的最小抑菌浓度大于0.8%，T、E/T和E/2T抗菌液对大肠杆菌的最小抑菌浓度均为0.4%，2E/T抗菌液对大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.2%。显然2E/T组对大肠杆菌的抑制作用最强。

表2 不同抗菌液对大肠杆菌的最小抑菌浓度结果Table 2 Results of the minimum inhibitory concentration of different antibacterial solutions to E. coli

由表3可知，E、T、E/T、E/2T抗菌液对对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度均为0.4%，而2E/T抗菌液对金黄色葡萄球菌的最小抑制浓度为0.2%。由表2和表3可知，丁香精油抗菌液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果最差，T、E/T和E/2T抗菌液的抑菌效果相似，2E/T抗菌液的抑菌效果最好；并且抗菌液对金黄色葡萄球菌的抑制效果要好于对大肠杆菌的抑制效果，这与刘倩等[6]的研究结果一致。刘倩等得出精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为0.5%和0.3%，与本实验结果接近。综合考虑，确定丁香精油/茶多酚复合抗菌液的最小抑菌浓度为0.4%，而且当E:T=2:1时，复合抗菌液的最小抑菌浓度为0.2%。

表3 不同抗菌液对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度结果Table 3 Results of the minimum inhibitory concentration of different antibacterial solutions to S. aureus

2.2 精油与茶多酚对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的协同抑菌作用

选择浓度为0.4%的抗菌液，考察丁香精油和茶多酚的协同抑菌效果，不同抗菌液的抑菌率及其协同系数结果列入表4和图1。由表4可知，复合抗菌液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用明显好于单一抗菌液，其中抑菌率最高的2E/T抗菌液对两种菌株的抑菌率分别为98.74%和74.81%。由抑菌率的结果可知，抗菌液对大肠杆菌的抑菌率明显高于对金黄色葡萄球菌的抑菌率，即对大肠杆菌的杀菌效果要优于对金黄色葡萄球菌的杀菌效果，这与上述最小抑菌浓度的实验结果不一致。这可能是因为大肠杆菌的对数生长期比金黄色葡萄球菌的短[27]，由于最小抑菌浓度实验的抑菌处理时间（24 h）大于协同效应实验的时间（14 h），早期被杀死的大肠杆菌在抗菌液的抑菌性减弱后（抗菌液的抑菌性随时间而变化）再次繁殖，从而导致最小抑菌浓度的实验结果与抑菌率实验结果相悖。

表4 不同抗菌液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的协同效果和抑菌率大小Table 4 Synergistic effects and bacteriostatic rate of different antibacterial solutions against E. coli and S. aureus

图1 不同抗菌液对大肠杆菌（a）和金黄色葡萄球菌（b）的杀菌效果Fig.1 The bactericidal effect of different antibacterial solutions on E. coli (a) and S. aureus (b)

由表4可知，EO与TP复合对大肠杆菌具有较强的协同作用，而对金黄色葡萄球菌仅在2E/T时具有协同效应，推测其协同抗菌的原因可能是丁香精油与茶多酚均能通过破坏细胞壁而影响细胞膜的通透性达到共同抑菌的作用[28]。与E/T、E/2T抗菌液相比，相同总浓度下，丁香精油含量更高的2E/T复合抗菌液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的协同系数和抑菌率更高。因此，本实验将2E/T作为抑制腐败菌种的最佳复合抗菌液。任艳丽等[29]通过三因素二次通用旋转设计计算出茶多酚（2.78%）、丁香精油（0.66%）和乳酸链球菌素（0.033%）进行复合得到的防腐液抑菌效果最佳，与本文协同抗菌结果不同的是，当乳酸链球菌素存在时，其复合抗菌液中茶多酚的含量最高，这可能是因为乳酸链球菌素提供了较高的抑菌作用而导致对丁香精油的含量降低。Wang等[30]研究发现，当茶多酚和曲酸按1:1复合时，两者对鱼类腐败菌种具有较强的协同抑菌作用。Sharma等[31]研究发现香茅精油、曲松精油、长叶精油和黄花精油之间对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有协同抑制作用，且可以显著降低它们的活性剂量，但未对精油与茶多酚的协同作用进行研究。

2.3 不同浓度的复合抗菌液对鱼类特征腐败菌的抑菌效果

不同浓度的复合抗菌液对副溶血性弧菌（V.Parahemolyticus）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小如表5和图2所示。

图2 不同浓度复合抗菌液对副溶血性弧菌（a）、铜绿假单胞菌（b）、大肠杆菌（c）和金黄色葡萄球菌（d）的抑菌圈大小Fig.2 The zone of bacteriostatic circle of V. Parahemolyticus (a),P. aeruginosa (b), E. coli (c) and S. aureus (d) under different concentrations of compound antibacterial solutions

由表5和图2可知，随着复合抗菌液总浓度的提高，对所有菌种的抑制能力均逐渐增大。复合抗菌液总质量浓度在0.4%时对四种菌种的抑制效果均为低度敏感，而在0.6%甚至更高浓度的情况下，对鱼产品特征腐败菌（铜绿假单胞菌和副溶血性弧菌）的抑菌效果都已经达到了极度敏感，推测其原因可能是因为茶多酚可以抑制铜绿假单胞菌中蛋白质的合成与表达，影响了酶的催化活性及其细胞结构的组成，导致细菌丧失正常的生理活性[32]，而且EO和TP均可以破坏副溶血性弧菌细胞膜的结构，使其细胞的通透性增加，从而影响细胞结构的新陈代谢活动导致其死亡[33]。复合抗菌液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果均处于中等敏感级别，且对大肠杆菌的抑菌效果好于对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，与抑菌率实验结果一致，两者抑菌观察时间接近。余小亮等[19]研究发现茶多酚与肉桂精油按1:1复合时获得的复合抗菌液浓度在0.4%～1.0%时，对金黄色葡萄球菌的抑制能力也处于中度敏感级别，与本实验中丁香精油/茶多酚复合抗菌液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果相似。综合考虑，2E/T抗菌液的质量浓度为0.6%时，抑菌效果最佳。

表5 复合抗菌液的浓度对不同菌种抑菌圈大小的影响Table 5 Effect of concentration of compound antimicrobial solution on the size of inhibition zone of different bacterial species

2.4 复合抗菌液对不同菌种的抑菌持久性结果

最佳协同比下，质量浓度为0.6%的复合抗菌液对不同菌种的生长抑制曲线如图3所示。由图3可知，随着培养时间的延长，2E/T-0.6对所有菌种的抑制曲线均是先增后减。复合抗菌液对铜绿假单胞菌的抑制性最强，在36 h达到最大值30 mm，至72 h才对其失去效力。其次是副溶血性弧菌，在24 h达到抑菌圈最大值，然后抑菌能力开始逐渐下降，直至60 h时对副溶血性弧菌失去效力。复合抗菌液对金黄色葡萄球菌抑制效果最大的时候也是在第24 h，然后逐渐下降至60 h时失去效力。复合抗菌液对大肠杆菌的抑制能力在12 h达到最高，且仅在前16 h左右的时间段时，大肠杆菌的抑菌圈略大于金黄色葡萄球菌，这与协同效应实验的结果相符。因此2EO/T-0.6对铜绿假单胞菌具有最高的抑菌效力，对副溶血性弧菌的抑制效果次之，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果相对较弱；对铜绿假单胞菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的有效抑菌时间分别为72 h、60 h、60 h和48 h。由此发现2E/T-0.6复合抗菌液对铜绿假单胞菌的抑制效果最好，推测原因可能是因为复合抗菌液中的多酚对铜绿假单胞菌的细胞膜蛋白破坏程度更强，因为多酚类抗菌剂对不同细菌的抑制能力大小取决于细菌对多酚的耐受力，而细菌对多酚的耐受力又取决于细菌的种类和多酚的结构[34,35]。茶多酚的结构基础主要为多酚基及多环结构，它对生物大分子如脂类、蛋白质、碳氢化合物和核酸有高度的亲和力，以致可以破坏细菌细胞膜的结构[36]。仪淑敏等[37]也研究证实了茶多酚使破坏铜绿假单胞菌的代谢发生紊乱，显著破坏铜绿假单胞菌的膜蛋白。刘文伟等[38]研究发现茶多酚对副溶血性弧菌的抑制效果约为36 h，由此可知，茶多酚与丁香精油进行复合后，其协同效应显著提高了抗菌液对副溶血性弧菌的抑制时长。

图3 最佳协同比下复合抗菌液对不同菌种的生长抑制曲线Fig.3 Growth inhibition curves of different antibacterial solution on different strains under optimal synergetic ratio

2.5 抗氧化性试验结果

2.5.1 2E/T-0.6对DPPH自由基的清除能力

抗氧化性的大小可以用抗氧化物质监测体系中（DPPH）的自由基清除能力来反应和表征。浓度对2E/T复合抗菌液DPPH自由基清除率的影响结果如图4所示。由图4可知，复合抗菌液的DPPH自由基清除率随着浓度的增加而缓慢增加，当质量浓度为0.6%时，达到86.68%，浓度进一步增加后，DPPH自由基清除率基本稳定不变。孙伟等[39]研究发现丁香精油的抗氧化作用在80%左右。余小亮等[19]研究的茶多酚与肉桂精油按1:1配制的复合保鲜剂（6 μg/mL）的DPPH清除率为66.23%，由此可知，该复合抗菌液具有更强的抗氧化性，推测原因可能是TP在发挥抗氧化作用后产生的游离基与精油相互作用产生新的酚类物质继续发挥作用，从而增强了DPPH自由基的清除效果[32]。

图4 不同总浓度的复合抗菌液对DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of different total concentration of compound antibacterial solutions on DPPH free radical clearance rate

2.5.2 2E/T-0.6对ABTS自由基的清除能力

ABTS易被氧化剂氧化成绿色的ABTS+，而当有抗氧化物存在时，ABTS+的形成就会被抑制，且在734 nm处有最大吸收值，因此在734 nm处测定吸光度即可计算出抗氧化物的总抗氧化能力[40]。浓度对2E/T复合抗菌液ABTS自由基清除率的影响结果如图5所示。由图5可知，复合抗菌液的ABTS自由基清除率随着浓度的增加而缓慢增加，当质量浓度为0.6%时，达到81.26%，继续增加浓度，ABTS自由基清除率基本保持不变，无显著性差异。韦芳媚等[41]研究发现0.6%的茶多酚对ABTS自由基清除率在80%左右，因此本文的复合抗菌液可以增强茶多酚的抗氧化能力。

图5 不同总浓度的复合抗菌液对ABTS自由基清除率的影响Fig.5 Effect of different total concentration of compound antibacterial solutions on ABTS free radical clearance rate

3 结论

本研究以丁香精油与茶多酚为原料，得到一系列的复合抗菌液。研究发现，当丁香精油与茶多酚的质量比为2:1时，两者协同作用最佳，对大肠杆菌的协同系数为4.46，对金黄色葡萄球菌的协同系数为1.04，且2E/T复合抗菌液的MIC为0.2%。该复合抗菌液对养殖鱼产品的特征腐败菌种（铜绿假单胞菌和副溶血性弧菌）具有良好的抑制作用。当复合抗菌液的质量浓度为0.6%，对铜绿假单胞菌和副溶血性弧菌的抑制时间分别为72 h和60 h。复合抗菌液具有很好的抗氧化性能，当质量浓度为0.6%，DPPH自由基清除率可达86.68%，ABTS自由基清除率可达81.26%，下一步将通过探讨不同菌种在复合抗菌液处理下的代谢变化、膜结构变化和蛋白质表达等揭示复合抗菌液对腐败菌种的抑菌机理，并将其应用于鱼类抗菌保鲜领域。