冠心病痰瘀相关标志物在中医药领域的研究进展❋

王 朔， 解 静， 徐一兰， 高树明， 李 琳， 高 杉， 于春泉

(天津中医药大学， 天津 301617)

心血管疾病是导致我国人群死亡及疾病负担的主要病因。据调查显示，缺血性脑卒中和心脏病分别在心血管疾病死亡占比为49.7%和37.8%，位居心血管疾病致死率首位[1，2]。我国每年因患冠心病死亡人数近300万，且发病率不断增加并呈年轻化态势，故早期诊断对于冠心病治疗意义重大。冠心病早期诊断基于患者的临床症状、心电图及生物标志物得以实现，其中生物标志物对于冠心病诊断尤为重要[3]。临床研究发现，开展以病证结合的中西医诊疗模式，对提高冠心病诊断和临床疗效方面作用显著。中医流行病学调查[4]表明，以痰浊、血瘀为证素的证型最为多见，痰瘀互结证冠心病是中医临床常见的辨证分型，因此开展冠心病痰瘀相关的证候本质研究，找到证候特异性标志物，将其作为微观辨证依据，是目前中医药防治冠心病研究的焦点。随着系统生物学的发展，运用现代组学技术从分子水平研究证候生物标志物，在揭示冠心病病理机制，早期临床诊断、评估和治疗以及药物研发意义重大。

笔者以“冠心病”“痰”“瘀”及“生物标志物”为主题词检索近10年相关文献，并从临床生化指标、蛋白组学技术、基因组学技术、代谢组学技术等方面做出梳理与总结，旨在为发现冠心病痰瘀相关特异性生物标志物，并用以早期临床诊断提出思考。

1 基于临床生化冠心病痰瘀相关标志物发现

目前对于冠心病痰瘀相关的临床常用指标主要以客观实验室指标特征结果居多，且多为蛋白类标志物。

1.1 冠心病痰瘀相关常见生化标志物的研究

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的标志物主要有肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)、心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)、肌红蛋白(myoglobin，Myo)等，其中CK-MB 是临床诊断AMI使用最多的标志物，cTn包括cTn I(cardiac troponin I，cTN I)和cTn T(cardiac troponin T，cTN T)，是诊断心肌损伤的“金标准”，是最具特异性、敏感性的标志物。Myo虽然特异性较低, 但具有良好的敏感性，三者常联合检测并作为诊断心肌缺血的主要证据，可以提高诊断心肌梗死的有效性和敏感性[5]。李伟海[6]研究表明，急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)不同证型与非ACS组比较差异明显，且痰阻心脉证患者CK-MB、高敏肌钙蛋白T(hs-cTn T)在不同证型中水平最高，气虚血瘀证患者Myo水平最高，对于在已有实验室检查情况下，诊断冠心病证型、评估患者心肌损伤状态具有参考价值。研究发现，心肌酶的变化在AMI不同证型中存在明显差异，阴血亏虚型患者与阳气亏虚型患者CK-MB、CK、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)、血清α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)异常率及均值明显高于痰浊闭塞型患者和气滞血瘀型患者，提示阴阳亏虚与心肌缺血标志物相关性更加密切[7]。

心脏型脂肪酸结合蛋白(heart fatty acid bindingprotein，h-FABP)是存在于心肌细胞胞质中的一种可溶性非结合、低分子量蛋白，在心肌损伤后可快速释放入血，且检测时间要优于肌钙蛋白T，因此是早期筛查ACS的重要标志物。刘福忠等[8]观察中医不同证型患者血清h-FABP及B型脑钠肽(type B natriuretic peptide, BNP)水平，发现冠心病心力衰竭患者h-FABP水平较高，且在不同中医证型间存在差异性，一定程度上可作为心衰患者中医辨证分型量化指标的参考依据。

B型脑钠肽(BNP)和氨基末端脑钠肽前体(n terminal pro b type natriuretic peptide, NT-pro B-NP)是在心室壁压力改变下，心肌细胞缺血和细胞因子分泌增加，从而导致血清浓度增加产生的肽类物质，是诊断心衰的重要标志物。赵华云等[9]将纳入研究的90例冠心病患者辨证分为心血瘀阻证、痰浊闭阻、心肾阳虚等3个证型，发现BNP水平与证型间有明显的相关性，且在上述证型中呈现依次递增趋势，表明不同证型与冠心病危险程度存在密切关系，提示BNP可指导冠心病辨证分型。王路宏[10]将76名心衰患者辨证分为气阴两虚、气虚血瘀、阳虚水泛等3个证型，结果显示阳虚水泛型患者的BNP值明显高于其他证型患者，说明BNP增高联合其他指标对心衰严重程度及预后判断更加规范和客观。

1.2 冠心病痰瘀相关炎症标志物的研究

动脉粥样硬化(AS)的病理特点是炎细胞浸润，冠心病作为一种炎症性疾病，炎症反应贯穿始终。众多研究指出冠心病与炎症、免疫密切相关，因此将炎症相关因子作为生物标志物的研究也越来越广泛，其中包括超敏C-反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、人可溶性细胞间黏附分子-1(soluble adhesion molecules，sICAM - 1)、血同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)等，对于早期诊断、治疗及准确判断预后提供帮助。刘燕琴[11]研究表明，冠心病患者血CRP、HCY、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL-C)水平高于健康人群，且不同中医证型之间存在的相关性，CRP、HCY、LDL-C水平越高越容易辨为气虚血瘀证，CRP、LDL-C水平越高越容易辨为痰瘀互阻证，为冠心病辨证分型的客观化提供参考。脂联素(adiponectin，APN)是一种主要由脂肪细胞分泌的生物活性多肽因子，具有抗炎的作用，并可抑制sICAM - 1的黏附，同时具有抗AS的作用。冠心病不同中医证型患者血清 sICAM - 1和APN含量存在差异，心血瘀阻证和阳气虚衰证患者上述指标明显高于痰阻心脉证和气阴两虚证患者，监测和关注二者的动态变化对于不同证型冠心病的诊断治疗具有指导意义，或可作为冠心病中医证型关联性研究及临床微观辨证的重要指标[12]。

2 基于蛋白质组学冠心病痰瘀相关标志物的发现

蛋白质组学是以蛋白质层面为研究对象，观察所有蛋白及其变化规律的一门科学。利用蛋白组学可以对存在于组织或体液中某一层面的蛋白进行定性定量研究，高通量筛查出各种因素引起的样本差异蛋白质谱，并对特异性生物分子功能进行分析，以此用于冠心病的诊断及治疗(见表1)。

表1 冠心病痰、瘀相关蛋白质标志物的研究

2.1 冠心病血瘀相关蛋白质标志物的研究

王刚[13]等采集冠心病心血瘀阻证和心肾阴虚证患者血浆，通过荧光差异蛋白电泳 (2 D-DIGE) 、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)，发现二者存在10种差异蛋白，包括聚集素和血清淀粉样p物质2种上调蛋白和血红素结合蛋白、载脂蛋白E等8种下调蛋白，分析发现阿尔兹海默症信号通路和补体凝血级联通路可能为2种证型辨证的相关通路。

孟永梅等[14]基于同位素标记相对和绝对定量(i TRQ)联合串联质谱技术(MS)，对慢性心力衰竭气虚血瘀证组和健康人组血清进行差异蛋白表达分析，鉴定出16个差异蛋白质，包括载脂蛋白E等11个表达上调的蛋白和5个表达下调的蛋白，为气虚血瘀证的客观研究开拓新思路。

Wang等[15]建立气虚血瘀证慢性心肌缺血小型猪模型，通过二维电泳图谱(2-DE)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行差异蛋白分析，发现异柠檬酸脱氢酶3α、还原型辅酶Ⅰ脱氢酶、Fe-S蛋白1、链A、热休克蛋白27等11种特征性蛋白，可能与NADH呼吸链和心肌损伤介导的能量代谢失调相关，为发现气虚血瘀证的潜在标志物提供线索。

刘如秀等[16]采用四级杆飞行时间质谱(Q- TOF)技术研究滋肾活血方对冠心病肾虚血瘀型大鼠缺血心肌蛋白表达，发现滋肾活血方调节乳酸脱氢酶B链、肉碱棕榈酰转移酶-2、异柠檬酸脱氢酶、ATP合酶α亚基、肌凝蛋白-6等蛋白表达明显，且这些差异蛋白表达可能与能量代谢、细胞骨架等作用相关。

尚青华[17]研究冠心病稳定期-潜毒-瘀毒过程自身血清蛋白质组学变化特点，鉴定得到“瘀毒”病机转变相关蛋白有人激肽原1(kininogen-1，KNG1)等4种，其中KNG1和过氧化物酶1(peroxiredoxin 1，PRDX1)是稳定期患者“瘀毒”病机转变的相关蛋白。

2.2 冠心病痰浊相关蛋白质标志物的研究

朱明丹等[18]对冠心病心血瘀阻证和痰浊内阻证进行差异蛋白分析，得到抗凝血酶等10种差异蛋白，富集通路主要与凝血系统、补体系统、脂质代谢及炎症反应系统相关，提示以上蛋白及通路可能是区别冠心病心血瘀阻证、痰浊内阻证等不同证型的蛋白标志物。

赵慧辉等[19]研究冠心病不稳定心绞痛气虚血瘀证患者、痰瘀互阻证患者及健康人的去高丰度蛋白血浆进行蛋白组学，发现反映气虚血瘀证蛋白表达变化的有结合珠蛋白α1链、α1抗胰蛋白酶等7个蛋白，痰瘀互阻证的有载脂蛋白C-Ⅲ、载脂蛋白A-Ⅱ等2个蛋白，二者在炎症反应、脂质代谢紊乱等方面表现一定的共性特征，但痰瘀互阻证表现得更为复杂。

崔佩佩等[20]以冠心病心气虚弱证和痰浊内阻证患者为研究对象，得出载脂蛋白H等12种蛋白水平在冠心病痰浊内阻证患者体内高表达，结合生物信学分析得到蛋白富集通路，包括血液连锁反应系、磷酸戊糖途径、半乳糖代谢、糖酵解等，提示区分痰浊证与心气虚弱证的客观量化证据，可从血液凝固、脂类代谢和能量代谢水平等方面查找。

3 基于基因组学冠心病痰瘀相关标志物发现

基因组学是通过基因芯片或分子测序等技术，研究整体水平基因组结构、功能及基因间相互作用规律的一门科学，主要包括结构基因组学、功能基因组学及比较基因组学[21]。利用基因组学可以对包括DNA和各层面信使RNA(mRNA)基因水平表达谱进行全面的高通量筛选，得到不同证候差异表达的基因组，并根据生物信息学方法对基因数据进行解读，有助于揭示中医病证的差异基因表达，并推断其功能和作用机理(表2)。

表2 冠心病痰瘀相关基因标志物的研究

3.1 冠心病血瘀相关基因标志物的研究

王阶课题组[22，23]利用高通量测序对冠心病血瘀证差异基因进行筛选，将所得差异基因进行匹配，构建长链非编码RNA-微小RNA-信使RNA(lncRNA-miRNA-mRNA)多层次调控网络，发现CTA-38D8.35等4个基因作为关键靶点，从转录组学层面阐释冠心病血瘀证的病理机制。

研究采用高通量测序分别从DNA甲基化、miRNA和mRNA不同层面对冠心病血瘀证患者基因进行筛选，确定miR194 promoter-miR194-丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路为关键通路，通过血塞通药物干预对该通路重要节点进行验证，证明冠心病血瘀证的发病机制[24]。

Liao等[25]通过检测冠心病血瘀证和缺血性中风血瘀证患者miRNA，发现血瘀证患者miR-146b-5p和miR-199a-5p明显上调，并通过定量即时聚合酶链锁反应(RT-PCR)靶向验证，证实miR-146b-5p和miR-199a-5p作为血瘀证生物标志物的可信度。

张月娟等[26]利用Aglient miRNA表达芯片，结合实验和临床研究筛选并构建冠心病慢性血瘀证miRNA调控网络，验证确定miR-24-3p、miR-223-3p、miR-106b-5p为关键基因，揭示冠心病血瘀证与炎症反应、免疫反应、能量代谢级细胞增殖凋亡等关系密切。

朱惠征[27]以冠心病ACS气虚血瘀证和气虚痰瘀证为研究对象，采用高通量长链非编码RNA(microRNA)表达谱，分别筛选出差异基因127条和72条，通过比对得到2组患者差异表达microRNA共4条，可作为二者辨证分型的客观依据。

3.2 冠心病痰浊相关基因标志物的研究

虞桂[28]以冠心病不稳定性心绞痛患者为研究对象，发现miR-363-5p、miR-668、丝氨酸/苏氨酸激酶2(recombinant receptor interacting serine threonine kinase 2，RIPK2)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶4(serine/threonine-protein kinase，STK4)与炎症和凋亡机制相关，可作为痰浊证生物标志物；miR-146b-5p、miR-199a-5p、人钙网蛋白(calreticulin，CALR)和肿瘤抑制蛋白(tumor protein P53，TP53)调节炎症和凋亡，可作为血瘀证生物标志物。

4 基于代谢组学冠心病痰瘀相关标志物发现

代谢组学是通过采集样本血浆、尿样等代谢产物，通过各种现代分离分析技术得到代谢产物谱，并结合生物信息学方法，寻找标志性代谢产物或代谢通路，并对其相应功能或变化趋势进行分析，为中医药现代化研究提供平台(表3)。

表3 冠心病痰瘀相关代谢标志物的研究

4.1 冠心病血瘀相关代谢标志物的研究

以冠心病血瘀证患者为研究对象，通过超高效液相色谱-串联质谱联用(UHPLC/MS)技术检测患者血液样本，发现柠檬酸等4种内源性代谢标志物，为继续探究冠心病血瘀证生物学基础及发现新药作用靶点提供新思路[29]。郑景辉等[30-33]对冠心病心血瘀阻证患者血浆、尿液代谢组学进行研究，主要涉及糖酵解和糖异生、丙酸代谢、脂肪酸生物合成等代谢通路，有望从以上通路深入研究，揭示血瘀证的生物学机制。郑娟娟等[34]研究发现，冠心病心血瘀阻证可能生物标志物有丙酮酸、磷酸甲酯、2-羟基戊酸等，并采用血府逐瘀汤干预进行验证，发现各靶点均有回调趋势，进一步证明丙酮酸等物质可作为心血瘀阻证标志物。

Zhao等[35]分别对冠心病心肌梗死小型猪和不稳定心绞痛患者血浆进行代谢组学检测，并与对照组比较分别发现21个和20个差异代谢物，通过主成分分析和聚类分析得到8个共有代谢物，为冠心病血瘀证的微观辨证指标提供依据。

采用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(LC-Q/TOF-MS)技术和多元统计分析方法筛选出大鼠血浆代谢产物，并用当归干预血瘀证大鼠确定具有明显变化的15个内源性代谢标志物，涉及有脂代谢、氨基酸代谢等途径[36]。Tan等[37]采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q/TOF-MS)技术，检测冠心病血瘀证大鼠血浆和尿液代谢物，发现皮质酮，3α，21-二羟基-5β-孕烷-11，20-二酮和19羟二十烷四烯酸和白三烯A4等代谢物与血瘀证相关，并通过血栓心脉宁片干预发现，可调节上述代谢物表达，为揭示血瘀证发病机制及血栓心脉宁片治疗作用提供参考。

朱明丹等[38]对心肌梗死恢复期气虚血瘀证患者血浆进行研究，发现磷脂酰胆碱、花生四烯酸、亚油酸等存在明显下调趋势，推测能量代谢、磷脂代谢等可能是气虚血瘀证的重要发病机制，为后期“方-证-效”对应验证生物标志物研究提供实验依据。

徐利云[39]建立不同证型胸痹大鼠模型，鉴别出气滞血瘀型生物标志物为L-蛋氨酸、L-高半胱氨酸、十八烷酰胺等，气虚血瘀型生物标志物为4-吡啶氧酸、棕榈酰溶血卵磷脂和3-羟基十六烷酸，发现证型多与能量代谢、氨基酸代谢等途径相关。

4.2 冠心病痰浊相关代谢标志物的研究

鹿小燕等[40]比较痰证、瘀证冠心病患者与健康人血清代谢产物，结果显示痰浊组和血瘀阻差异代谢物主要包括苹果酸、琥珀酸、果糖、葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸和棕榈烯酸等。程鹏[41]测定痰浊证、气虚证血浆代谢物，分析显示丝氨酸、缬氨酸、2羟基丙酸、花生四烯酸甲酯等物质差异性最大，可作为区别2种证型差异标志物。分别对12例冠心病痰浊痹阻证、气虚血瘀证和气滞血瘀证患者血、尿代谢物进行检测，并从能量代谢、糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢等方面分析出差异代谢标志物，其中乳酸、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰糖蛋白等可能是区分不同证型的标志物[42，43]。

陈浩等[44]利用代谢组学技术，分别检测冠心病气虚血瘀证组和气虚血瘀痰浊证组不同人群的血液、尿液代谢物，发现气虚血瘀证组潜在生物标志物有天冬氨酰蛋氨酸等，气虚血瘀痰浊证组的标志物有马尿酸等，为临床对不同证型冠心病防治提供借鉴。

Li[45]采用UPLC-Q-TOF/MS技术对丹蒌方主要化学成分进行定性分析，通过丹蒌方干预冠心病痰瘀互结证大鼠模型，鉴定大鼠血清中甜菜碱、γ-亚麻酸、亚油酸、11,14,17-二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸等17种生物标志物，分析得出丹蒌方可通过改善能量代谢、甘油磷脂代谢等途径，发挥对痰瘀互结型冠心病的治疗作用。

5 讨论

目前开展冠心病痰瘀相关标志物研究众多，综合来看，主要运用蛋白组学、基因组学、代谢组学等系统生物学技术以及IPA、MetaCore、KEGG数据库及网络药理学等生物信息学分析方法，通过对比不同证型间的差异蛋白、基因、代谢物等找出相应生物标志物，涉及到脂质代谢、能量代谢、炎症反应等途径及作用机制颇多，对于深入研究冠心病不同证型候选标志物，尤其是痰瘀互结证的关键性分子，实现疾病与证候的准确诊断具有指导意义[46-49]。随着组学技术与生物信息学方法结合日臻完善，多学科交叉融合揭示中医药理论内涵和本质规律成为中医药领域研究的新风尚，联合多组学技术进行冠心病痰瘀互结证的研究或可成为未来深化冠心病病证结合、方证对应视角下中药新药开发研究的趋势[50，51]。

当然，组学技术支持下冠心病痰瘀相关证型的研究，筛选并鉴定出的生物标志物种类繁多，存在标志物特异性不明确的问题，这就需要研究者在明确辨证分型的基础上，提高对病证诊断、治疗量化、规范化标准。此外，不同层面的标志物如何进行有效的关联性分析与结合，如何对标志物所在路径及作用机制进行深入探讨，是否需要大样本前瞻性研究对以往研究进行补充和验证，这些问题仍值得研究者思考与探索[52，53]。