聚酰胺/聚丙烯蒸煮袋中2,4-二氨基甲苯和4,4’-二氨基二苯甲烷向酸性食品模拟物的迁移分析

官铃淇，蔡翔宇，陈 璐，张勤军，程 娟，余稳稳，吕春秋，吴玉杰,4,，胡长鹰,

（1.暨南大学理工学院，广东 广州 510632；2.南宁海关技术中心，广西 南宁 530021；3.暨南大学包装工程学院，广东省普通高校产品包装与物流重点实验室，广东 珠海 519070；4.中国检验检疫科学研究院，北京 100176）

随着现代食品加工工艺的发展，市场对于食品包装的功能性需求越来越高，因此复合食品接触材料成为应用广泛的软包装材料之一。复合材料在复合过程中通常会用到胶黏剂，尤其是聚氨酯胶黏剂[1-2]。常见的聚氨酯胶黏剂主要由主剂和固化剂2 部分组成，其中主剂通常是聚醚和聚酯类化合物等多元醇，2 种主要的固化剂分别为甲苯二异氰酸酯（toluene diisocyanate，TDI）和二苯甲烷二异氰酸酯（diphenyl methane diisocyanate，MDI）[3]。 由于TDI和MDI单体极易与水生成对应的初级芳香胺（primary aromatic amines，PAAs）产物2,4-二氨基甲苯（2,4-diaminotoluene，2,4-TDA）和4,4’-二氨基二苯甲烷（4,4’-diaminodiphenylmethane，4,4’-MDA）[4]，因此在复合包装材料使用MDI或者TDI作为固化剂时，其在使用过程中，极有可能产生并释放出PAAs，并迁移至被包装的食品中，引起食品安全隐患。

PAAs是一类典型的有毒有害物质，世界卫生组织和国际癌症研究机构已将一些PAAs归类为“人类致癌物”[5]。例如，2,4-TDA和4,4’-MDA被列在2B组中（可疑人类致癌物），因此，应避免其在食品中的存在。欧盟食品接触材料法规（EU）NO.10/2011[6]中明确规定“所有塑料食品接触材料，特别是深颜色制品、黑色尼龙制品、食品复合包装袋，不可释放出芳香族伯胺类物质，检出限（limit of detection，LOD）即迁移限量为0.01 mg/kg”，此限量仅适用于释放的PAAs总量，没有对单个芳香胺进行限量。目前欧盟正在对（EU）NO.10/2011进行进一步修订，对毒性较大的PAAs，预计其特定迁移量的LOD将降低至0.002 mg/kg[7]。 国内关于食品接触材料法规主要针对部分产品的PAAs进行管控。目前我国正在起草《食品安全国家标准 食品接触用复合材料及制品（征求意见稿）》要求PAAs迁移量为不得检出（LOD为0.01 mg/kg）[7]。

近些年，国内外关于食品接触材料中PAAs的研究报道越来越多，而分析方法主要采用分光光度法[8-10]、高效液相色谱法[11-13]、液相色谱-质谱法[14]、气相色谱-质谱法[15-17]、液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[18-20]等。 其中，分光光度法、高效液相色谱法易受到杂质干扰影响，造成假阳性[18]。液相色谱-质谱法能够避免假阳性，但对于复杂样品仍存在干扰，导致检测限过高，定量不准。气相色谱-质谱法可同时对PAAs迁移量进行定性和定量分析，但食品模拟物浸泡液需经过调pH值、提取、浓缩、氮吹、定容等处理步骤，鉴于PAAs稳定性较差，繁琐的前处理过程容易影响结果的准确性[20]。目前水性食品模拟物中PAAs的大多数测定方法均基于LC-MS/MS技术。这主要是由于LC-MS/MS在多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）采集模式下，具有高灵敏度和选择性的优点。此外，在迁移实验结束后，无需任何预处理操作可以直接进行测定，这使该技术对PAAs的快速筛选分析具有重要价值[18,21]。

尼龙/聚丙烯（polyamide/cast polypropylene，PA/CPP）蒸煮袋是一类常见的复合包装材料，在包装食物的同时，可以进行高温灭菌、蒸煮、微波等恶劣工况的应用。而包装食品在进入市场之前（防腐热处理等）和之后（真空烹饪等）的70 ℃以上的食品加工处理过程可能会促进包装材料中PAAs的生成和迁移，这种情况往往易被忽略[22]。因此，本实验主要采用LC-MS/MS研究不同工况下常见复合材料中2,4-TDA和4,4’-MDA向酸性模拟物中的迁移规律，并根据研究结果对不同热加工处理方式中食品复合包装材料的使用安全性提出建议。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市场上购买6 种不同品牌的PA/CPP蒸煮袋，编号分别为PA-1～PA-6，为排除油墨中可能存在PAAs对实验造成影响，所有包装袋未经印刷。

2,4-TDA（纯度＞99%）、4,4’-MDA（纯度＞99%）标准品 德国Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇、乙酸（均为色谱纯） 美国Tedia公司；甲酸（分析纯） 上海安谱科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DGU-20A高效液相色谱仪 日本岛津公司；QTRAP5500三重四极杆质谱仪 美国AB SCIEX公司；Vortex-Genie2涡旋振荡器 美国Scientific Industries公司； AJ-320真空封口机 奥德居包装机械有限公司；XS204分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；MLS-3781-PC高温灭菌锅 日本三洋公司；SLK-2电热红外加热板 德国Wiggens公司；HHS21-8恒温水浴锅 上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；Milli-Q 7010超纯水机 德国默克公司；针式过滤器（孔径0.22 µm） 上海安谱科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备溶液（1 000 mg/L）：准确称取2,4-TDA和4,4’-MDA标准品各0.01 g并分别放入2 个10 mL容量瓶中，用甲醇进行稀释定容后利用涡旋振荡器充分混匀30 s后，得到质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液，于4 ℃冰箱避光密封保存。

标准中间溶液（10 mg/L）：分别吸取100 µL 2,4-TDA和4,4’-MDA标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇进行稀释定容后利用涡旋振荡器充分混匀30 s后，即得到质量浓度为10 mg/L的混合标准中间液，中间液于4 ℃冰箱保存。

标准工作溶液：准确吸取100 μL混合标准中间液于10 mL容量瓶中，用4%乙酸溶液进行稀释定容后利用涡旋振荡器充分混匀30 s后，得到质量浓度100 μg/L工作溶液。再依次将100 μg/L的混合标准工作溶液依次稀释得到质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L的混合标准工作溶液。

1.3.2 仪器条件

色谱条件：C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL；流动相A为0.1%甲酸（甲酸-水，0.1∶99.9，V/V）溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱条件：0～1.0 min，90% A，10% B；1～2.2 min，90%～70% A，10%～30% B；2.2～4.0 min，70%～5% A，30%～95% B；4.0～5.0 min，5% A，95% B；5～6 min，5%～90% A，95%～10% B；6～8 min，90% A，10% B。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子模式；MRM； 2 种PAAs的质谱参数见表1。

表1 2,4-TDA和4,4’-MDA的质谱参数Table 1 Mass spectrometric parameters of 2,4-TDA and 4,4’-MDA

1.3.3 制袋

为了模拟复合包装袋内层与食品的实际接触情况，并保持食品模拟液在迁移过程中的完整性，选择制袋法进行迁移实验。GB 23296.1—2009《食品接触材料 塑料中受限物质 塑料中物质向食品及食品模拟物特定迁移试验和含量测定方法以及食品模拟物暴露条件选择的指南》[23]中规定迁移实验，采用袋装实验的表面积-体积比一般为2 dm2食品接触面积比100 mL食品模拟物。将6 种包装袋统一裁剪成8 cm×12 cm的袋子，然后用无水乙醇将袋子表面擦拭干净。有研究表明PAAs在酸性环境下容易迁出[18,24-25]，同时GB 31604.1—2015《食品接触材料及制品迁移试验通则》[26]中规定在迁移实验中用4%乙酸溶液作为酸性食品模拟物。因此本实验选用4%乙酸溶液作为食品模拟物，取96 mL 4%乙酸溶液倒入制好的袋中，用热封机封口。

1.3.4 初筛

复合包装袋中胶黏剂由于温度升高导致化学键断裂会不断产生异氰酸酯单体，异氰酸酯单体遇水后生成PAAs[22]，所以包装袋的复合材料内2,4-TDA和4,4’-MDA含量是动态变量。根据GB 31604.1—2015中规定的总迁移实验条件，分别对6 种PA/CCP蒸煮袋在100 ℃、2 h条件下的2,4-TDA和4,4’-MDA迁移量进行比较，并选择容易迁出2,4-TDA和4,4’-MDA的样品袋继续进行不同工况下的迁移研究。根据PA/CPP蒸煮袋的预期使用条件，将1.3.3节中制备得到的PA/CPP蒸煮袋放至100 ℃水浴锅内，加热2 h。迁移实验完成后，待迁移液冷却至室温，用注射器抽取1 mL迁移液过0.22 μm有机滤膜后装入进样瓶，存放在4 ℃冰箱中待测，每组3 个平行。同时将1.3.3节中制备得到的PA/CPP蒸煮袋常温存放2 h作空白对照。

1.3.5 巴氏杀菌

由于巴氏杀菌在实际应用中存在65～95 ℃的加热范围[27-29]，因此选用70 、90 ℃两种不同温度进行迁移实验。将1.3.1节中制备得到的PA/CPP样品袋放入水浴锅中水浴加热20、40、60、80、100 min。迁移实验完成后，待样品袋冷却至室温，用注射器抽取1 mL迁移液过0.22 μm有机滤膜后装入进样瓶，存放在4 ℃冰箱中待测，每组3 个平行，同时做空白对照。

1.3.6 蒸煮

煮：烧杯中装入一定量的水，放在电热板上加热至沸腾。然后将1.3.3节中制备得到的PA/CPP样品袋放入沸水中加热10、20、30、40 min。迁移实验完成后，待样品袋冷却至室温，用注射器抽取1 mL迁移液过0.22 μm有机滤膜后装入进样瓶，存放在4 ℃冰箱中待测，每组3 个平行，同时做空白对照。

蒸：将家用锅装入一定量的水，放在电热板上加热至沸腾。将1.3.3节中制备得到的PA/CPP样品袋带放在蒸架上一同放入锅中加热10、20、30、40 min。迁移实验完成后，待样品袋冷却至室温，用注射器抽取1 mL迁移液过0.22 μm有机滤膜后装入进样瓶，存放在4 ℃冰箱中待测，每组3 个平行，同时做空白对照。

1.3.7 高温灭菌

将1.3.3节中制备得到的PA/CPP样品袋放入蒸汽灭菌锅中，在121 ℃[30-31]下分别灭菌5、10、15 min。迁移实验完成后，待样品袋冷却至室温，用注射器抽取1 mL迁移液过0.22 μm有机滤膜后装入进样瓶，存放在4 ℃冰箱中待测，每组3 个平行，同时做空白对照。

1.3.8 紫外灭菌

将1.3.3节中制备得到的PA/CPP样品袋置于波长253.7 nm[32]紫外线杀菌20、40、60 min。迁移实验完成后，用注射器抽取1 mL迁移液过0.22 μm有机滤膜后装入进样瓶，存放在4 ℃冰箱中待测，每组3 个平行，同时做空白对照。

1.3.9 2,4-TDA和4,4’-MDA迁移量的计算

复合包装袋中PAAs迁移量按下式计算：

式中：M1为包装袋中2,4-TDA和4,4’-MDA的迁移量/（μg/kg）；C1为LC-MS/MS测得4%乙酸溶液中 2,4-TDA和4,4’-MDA的质量浓度/（μg/L）；m1为96 mL食品模拟液的质量/kg；V为袋中食品模拟物的体积/L；f为试样的稀释倍数。

1.4 数据处理

利用AB SCIEX LC-MS/MS Mass hunter工作站进行数据分析，用Excel和Origin 9.0对数据结果进行统计分析和作图，Minitab 17对结果进行显著性分析 （P＜0.05，差异显著）。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

分别用50%甲醇溶液配制质量浓度为100 μg/L的2,4-TDA和4,4’-MDA标准溶液，采用流动注射泵连续进样方式，选择正负离子扫描模式分别对2,4-TDA和 4,4’-MDA两种标准溶液进行全扫描，确定准分子离子峰，优化锥孔电压；然后以定准分子离子峰为母离子，对其子离子进行扫描，选取丰度最大的2 个离子作为子离子，其中丰度较大的作为定量离子，离子丰度相对较小的作为定性离子，并对碰撞能量进行优化，最终MRM参数 见表1，混标总离子流图见图1。

图1 4,4’-MDA和2,4-TDA混标的总离子流图（1 μg/kg）Fig. 1 Total ion current chromatograms of mixed 4,4’-MDA and 2,4-TDA standards (1 μg/kg)

2.2 线性方程、LOD及LOQ结果

用4%乙酸溶液分别配制质量浓度为0.05～5.0 μg/L的混合标准工作溶液。以定量离子峰面积（y）为纵坐标，对应的质量浓度（x，μg/L）为横坐标，绘制标准曲线，外标法定量。以信噪比不小于3计算LOD，以信噪比不小于10计算定量限（limit of quantitation，LOQ），结果如表2所示。2 种PAAs化合物的定量离子峰面积与其质量浓度在一定范围内呈良好的线性关系，相关系数（R2）均大于0.999 8；LOD均不大于0.02 μg/L，LOQ均不大于0.05 μg/L，满足GB 9685—2016《食品接触材料及制品用添加剂使用标准》中对PAAs类限量的要求。

表2 2,4-TDA和4,4’-MDA的线性参数、LOD与LOQTable 2 Analytical figures of merit for 2,4-TDA and 4,4’-MDA

2.3 加标回收率及精密度结果

实验选取经检测不含2,4-TDA的PA/CPP蒸煮袋以及不含4,4’-MDA的PA/CPP蒸煮袋，用4%乙酸溶液分别配制成0.1、0.5、1、5 μg/L 4 个质量浓度的2,4-TDA加标溶液以及4,4’-MDA加标溶液。按1.3.4节方法进行迁移实验，每个质量浓度做6 个平行实验，计算加标回收率和精密度（表3）。4 个加标水平下的回收率为69.0%～95.1%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）（n=6）为1.9%～6.3%，满足分析方法相关要求。

表3 2,4-TDA和4,4’-MDA标准溶液的平均回收率和RSD（n=6）Table 3 Recoveries and RSD of 2,4-TDA and 4,4’-MDA standard solutions (n = 6)

2.4 迁移结果

2.4.1 初筛结果

如表4所示，6 种蒸煮袋在100 ℃、2 h条件下均有2,4-TDA或4,4’-MDA检出，且在每种蒸煮袋当中，只有2,4-TDA和4,4’-MDA中的一种物质被检出，这可能是由于不同包装袋中的胶黏剂使用的异氰酸酯固化剂不同，因此只生成其所使用固化剂对应的PAAs产物。而在空白实验中，6 种蒸煮袋中2,4-TDA和4,4’-MDA均未检出，说明2,4-TDA和4,4’-MDA在常温条件下是比较难迁出的。据初筛结果还可发现，4 种包装袋使用的固化剂为MDI，2 种使用TDI作为固化剂。此外，研究结果还显示，相同迁移条件下，2,4-TDA的迁移量远低于4,4’-MDA （P＜0.05），这可能是由于TDI作为固化剂的胶黏剂热稳定性更好。

根据初筛结果，在6 种PA/CPP蒸煮袋中选出2 种 4,4’-MDA迁移量较高的样品和1 种2,4-TDA迁移量较高的样品作为实验材料，进行后续的迁移研究。如表4所示，选择PA-1（2,4-TDA）、PA-3（4,4’-MDA）、PA-6 （4,4’-MDA）号袋作为PA/CPP材料实验样品。

表4 6 种样品信息及检测结果（n=3）Table 4 Migration amounts of 2,4-TDA and 4,4’-MDA from six commercial brands of retort pouches (n = 3)

2.4.2 巴氏杀菌对2,4-TDA和4,4’-MDA向4%乙酸溶液 迁移的影响

在70、90 ℃不同温度下，迁移时间控制在100 min内时3 种PA/CPP样品袋中2,4-TDA或4,4’-MDA在乙酸中的迁移量有检出，但都低于方法LOQ（0.05 μg/kg），不能准确定量。分析上述结果，可能是因为3 种PA/CPP蒸煮袋中所使用的胶黏剂在此温度范围内存在一定耐热性，减缓了异氰酸酯单体生成，使在此条件下的2,4-TDA和4,4’-MDA迁移量较低。但对比空白实验结果可知，巴氏杀菌条件仍对PA/CPP蒸煮袋中2,4-TDA和4,4’-MDA向4%乙酸溶液迁移有一定的促进作用。

2.4.3 蒸煮工况对2,4-TDA和4,4’-MDA向4%乙酸溶液迁移的影响

根据PA/CPP蒸煮袋的预期使用条件，研究蒸、煮条件对PA/CPP蒸煮袋中2,4-TDA和4,4’-MDA向4%乙酸溶液迁移的影响，结果如图2所示。根据图2A可知，对于PA-3和PA-6两种蒸煮袋，随着蒸、煮时间的延长，2 种蒸煮袋中的4,4’-MDA迁移量逐渐升高，4,4’-MDA的迁移量在0.167～0.81 μg/kg之间，迁移量低于欧盟法规（EU）NO.10/2011中对PAAs的迁移限量（0.01 mg/kg）， 同时也低于欧盟正在修订的对单个PAAs的迁移限量（0.002 mg/kg），因此在此条件下是比较安全的。根据图2B可知，随着蒸煮时间的延长，PA-1中的2,4-TDA迁移量也逐渐升高，其中2,4-TDA的迁移量最小值小于0.05 μg/kg，最大值为0.189 μg/kg，同样比较安全。同时还发现，在加热相同时间时，PA-3和PA-6两种蒸煮袋中4,4’-MDA在煮时的迁移量均高于蒸时的迁移量，差值在0.034～0.259 μg/kg之间；而在加热时间超过20 min后，PA-1中2,4-TDA在煮时的迁移量同样也高于蒸时的迁移量，差值在0.023～0.059 μg/kg之间。可以推测，在对蒸煮袋包装食品进行加热时，蒸是相对更好的方式。

图2 蒸煮条件下蒸煮袋2,4-TDA和4,4’-MDA向4%乙酸溶液中的迁移量Fig. 2 Migration amounts of 2,4-TDA and 4,4’-MDA from PA/CPP retort pouches to 4% acetic acid solution under cooking conditions

2.4.4 高温蒸汽灭菌对2,4-TDA和4,4’-MDA向4%乙酸溶液迁移的影响

如图3所示，随着处理时间的延长，蒸煮袋中 2,4-TDA和4,4’-MDA的迁移量均显著增加。其中PA-3、PA-6中4,4’-MDA的迁移量在0.722～3.113 μg/kg之间，均在15 min内分别达到2.733 μg/kg和3.113 μg/kg，尽管迁移量并未超过目前欧盟对于PAAs的迁移限量（0.01 mg/kg）， 但已经明显高于欧盟正在修订的对单个PAAs的迁移限量（0.002 mg/kg），因此高温灭菌对复合膜中PAAs迁移的影响需要重点关注。而PA-1中2,4-TDA的迁移量在0.166～0.714 μg/kg之间，迁移量仍低于0.002 mg/kg，相比PA-3、PA-6蒸煮袋更安全。

图3 121 ℃杀菌条件下，PA/CPP样品中4,4’-MDA和 2,4-TDA在4%乙酸溶液中的迁移量Fig. 3 Migration amounts of 4,4’-MDA and 2,4-TDA from PA/CPP retort pouches to 4% acetic acid solution under 121 ℃ sterilization conditions

2.4.5 紫外杀菌对2,4-TDA和4,4´-MDA向4%乙酸溶液迁移的影响

紫外处理样品袋后，在3 种样品袋中的迁移液中均未检出2,4-TDA和4,4’-MDA，迁移结果与空白一致。分析结果，相比紫外杀菌，胶黏剂受温度的影响可能更大，在紫外照射过程中，没有明显的加热效果，因此对胶黏剂中PAAs的迁移没有显著影响。

2.4.6 工况对2,4-TDA和4,4’-MDA向4%乙酸溶液迁移的影响

如图4所示，巴氏杀菌条件下，3 种蒸煮袋中 2,4-TDA或4,4’-MDA的迁移量均低于定量范围，无法准确定量。结果显示，3 种蒸煮袋中2,4-TDA或4,4’-MDA的迁移量最大值都随热处理温度的升高而显著增大 （P＜0.05），这说明，不论胶黏剂中固化剂使用的是TDI还是MDI，在热处理条件下，都会促进它们所对应PAAs产物的迁移，并且随着处理温度的升高，这种促进效果越明显；另外，虽然蒸煮袋所使用的耐高温材料能够保证在高温条件下不发生物理形变，但由于胶黏剂受高温影响，PAAs的迁移量仍会随温度的升高而增加。因此，在对复合材料包装的食品进行防腐热处理时，不能只关注是否发生物理变形，可能导致的食品安全也需要重点关注。

图4 不同工况下PA/CPP样品中4,4’-MDA和2,4-TDA在 4%乙酸溶液中的最大迁移量Fig. 4 Maximum migration amounts of 4,4’-MDA and 2,4-TDA from PA/CPP retort pouches to 4% acetic acid solution under different heat treatment conditions

3 结 论

PA/CPP是一种常见的蒸煮袋复合材料，由于复合过程中胶黏剂的加入，并且在使用过程中经历不同工况，有可能导致有害物质PAAs的产生并迁出，引发食品安全问题。本实验应用LC-MS/MS测定了PA/CPP蒸煮袋中 2,4-TDA和4,4’-MDA物质的迁移量，并研究了不同加工方式对这2 种物质迁移量的影响。研究发现，除紫外杀菌对2,4-TDA和4,4’-MDA的迁移无显著影响外，蒸、煮、巴氏杀菌、高温灭菌均会明显促进PA/CPP蒸煮袋中 2,4-TDA和4,4’-MDA向4%乙酸食品模拟物的迁移，迁移量随着迁移温度的升高显著增加（P＜0.05）。

实验结果显示，在121 ℃高温灭菌15 min条件下，PA/CPP样品袋中4,4’-MDA的迁移量均显著高于欧盟正在修订的对单个PAAs的迁移限量，因此在对复合材料包装的食品进行热处理时，杀菌方式运用不当，可能会导致食品安全问题。可见，在利用复合材料包装食品时，热处理方式对胶黏剂中PAAs的迁移及食品安全的影响值得重点关注。