狗牙根地下芽休眠进程中生理物质的变化规律

王雪如，闫 锋，张海燕，马金燕，张延辉

(新疆农业大学草业与环境科学学院/西部干旱荒漠区草地资源与生态教育部重点实验室/新疆草地资源与生态自治区重点实验室，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】狗牙根(CynodondactylonL.)是一种典型的具有休眠特征的多年生草本，在草坪绿地中应用广泛，属于C4途径的植物，抗旱性很强，但当秋季降临，其上部茎叶即慢慢枯黄，进入休眠，是狗牙根生存的策略之一[1-2]，狗牙根是一种暖季型草坪草，在入秋后缓慢进入枯黄，即进入休眠状态，由地下根茎及芽维持生命，芽内的生理物质在响应休眠的过程中发挥重要作用，研究狗牙根休眠过程中生理物质的变化规律，了解狗牙根资源的生长习性，对于如何更好的在草坪绿地建设中发挥作用具有重要意义。【前人研究进展】多年生草本植物，营养繁殖是其繁衍的主要方式之一，地下部分尤其是根部的休眠芽对于植株的再生有非常重要的作用。羊草地下芽库中各类型芽及所形成子株和母株的季节动态变化研究结果表明，当年返青母株是由上1年母株形成的80%的分蘖芽与分蘖芽子株，15%的根茎顶芽与根茎顶芽子株，以及5%根茎节芽和根茎节芽子株组成的，分蘖芽与分蘖芽子株是返青母株的主体[3]。分蘖特性是草坪绿地质量的关键。休眠是次年分蘖诱发的主要影响因素，分蘖芽通常都经历过休眠过程。植物进入休眠期后，各项生理物质都会发生变化。盖树鹏等[4]研究牡丹芽休眠的生理机制，发现活性氧、自由基在低温处理初期迅速上升、保护酶系初期保持较低的活性，有利于保持较高膜脂过氧化水平，增加膜脂透性，促进休眠解除；休眠基本解除时，活性氧迅速下降。膜脂过氧化可能作为休眠解除的信号物质在早期起作用。刘国琴等[5]研究中华寿桃花芽在2013～2015年2年度间休眠进程，发现花芽内休眠及其解除过程中花芽可溶性蛋白质含量逐渐降低，而总氨基酸含量则逐渐升高，POD活性和H2O2含量呈相似的变化趋势；抗坏血酸(AsA)含量呈现“升-降-升-降”的变化规律。Somayeh Esmaili等[6]研究发现，狗牙根降低温度和光照时间会增加脯氨酸含量；在芽和根中，还原糖随温度降低而增加，而随光持续时间降低而下降。Matthew J. Fagerness等[7]研究发现，当温度较低时，导致狗牙根草坪密度和质量下降，低温降低了狗牙根的竞争力，而低温是诱发狗牙根休眠的主要原因。【本研究切入点】针对植物休眠的研究，大多数都集中在木本植物芽的休眠或者种子的休眠，在草本植物中对根茎上芽的休眠研究很少，对于狗牙根芽休眠的机理研究几乎未见报道。作为一种复杂的生命活动过程，芽休眠受多个因素的综合调控[8]，研究渗透调节物质、膜质氧化、几种关键酶的变化等解析狗牙根芽休眠的生理变化动态。【拟解决的关键问题】采集8种不同地区狗牙根的地下芽，对狗牙根芽体进行渗透调节、膜质氧化、酶活性等生理指标的测定。研究狗牙根地下芽休眠的生理响应规律，分析狗牙根休眠时生理物质响应规律，为研究狗牙根休眠机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验区位于新疆农业大学三坪实习基地内，该区域87°40′24″E、43°46′12″N，海拔约739 m。昼夜温差大，寒暑变化剧烈，降水偏少，四季分配不均，冬季长，夏季短，春秋不明显，常出现大风和骤然降温天气。全年平均气温7.2℃，1月平均气温-17℃，7月平均气24.6℃，极端最高气温42℃，极端最低气温-38℃。年均降水量228.8 mm，年均蒸发量2 647 mm。试验地土壤类型为沙性壤土，无盐碱危害，土壤土层较厚，土壤理化性状和土壤质地良好。

在2019年度采集新疆农业大学草坪草资源圃内的8种狗牙根材料(品种)，将其营养体(根茎)种植于花盆内，在新疆农业大学网室栽培养护。表1

表1 8种狗牙根材料采集地点Table 1 Collection sites of eight Cynodon dactylon (L.) Pers.

1.2 方 法

狗牙根夏季生长旺盛，在9月下旬缓慢进入休眠状态，地上部分叶片逐渐变黄。在2019年8月6日(未休眠)、9月16日(休眠起始)和10月16日(休眠中)3个不同时间段，分别采集8份狗牙根种质材料的地下芽，每份种质材料取30个。采集的芽用锡箔纸包好迅速放入液氮罐中，带回实验室后取出放入-80℃冰箱中保存备用。

采集的狗牙根芽体进行常规生理指标的测定，游离脯氨酸含量采用茚三酮法，可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法，SOD、POD活力、MDA含量，均参照李合生的方法[9]。

1.3 数据处理

芽体使用软件LASV4.6采集图像并作对比。试验结果采用Excel 2010、SigmaPlot 12.5和SPSS 21等软件进行数据整理、统计分析。

2 结果与分析

2.1 游离脯氨酸含量

研究表明，在休眠前期-休眠起始-休眠进入3个阶段(8月、9月、10月)，狗牙根地下芽体内的脯氨酸含量随着温度下降，总体呈上升趋势，变化范围为296.157～839.1 364 μg/gFW。在未休眠阶段(8月)，脯氨酸整体含量与9、10月相比都比较低，其中，C45含量最低(35.069 6 μg/gFW)，C130含量最高为499.447 μg/gFW，其次是C48为430.061 μg/gFW。在休眠起始阶段(9月)，除个别材料外(新农1号、托克逊)，其余狗牙根芽中脯氨酸含量均有增加，C130含量最高为1 058.79 μg/gFW。在休眠中的阶段(10月)，狗牙根芽中脯氨酸含量达到最大值，其中，C45脯氨酸含量值为752.515 μg/gFW，C130达到最大值为1 072.84 μg/gFW。图1

图1 不同休眠时期狗牙根芽内脯氨酸含量比较Fig.1 Comparison of proline content in budof Cynodon dactylon (L.) Pers.during different dormancy period

2.2 可溶性蛋白含量

研究表明，8月可溶性蛋白含量很低，C66含量最低为0.000 1 mg/g，C48含量最高为0.002 mg/g，与9、10月相比，差异显著(P<0.05)。9月可溶性蛋白含量增加，C66含量为0.567 mg/g，C48含量增加到1.595 mg/g，C133可溶性含量为2.021 mg/g，表明在休眠起始，可溶性蛋白开始显著增加。进入休眠中(10月)，可溶性蛋白继续增加，C66和C130含量较高，分别为4.338和4.367 mg/g，C48含量也有增加，值为1.787 mg/g，但增加幅度显著低于其他地区狗牙根。C133持续增加到3.644 2 mg/g。图2

图2 不同时间段可溶性蛋白含量比较Fig.2 Comparison of soluble protein content in different time interval

2.3 保护酶系统

2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性

研究表明，狗牙根芽体内SOD活性随时间变化先升高后降低。8月新农3号芽内的SOD活性最低为86.469 μ/gfW，显著低于其他地区狗牙根(P<0.05)，C133芽内酶活性高于其他地区狗牙根芽，活性值为174.781 μ/gfW。9月狗牙根芽内的活性均升高，新农3号芽内酶活性增加至170.883 μ/gfW，C133增加到204.515 8 μ/gfW，其中C66SOD活性最低为168.375 μ/gfW，C45SOD活性最高为237.48 μ/gfW，显著高于其他地区狗牙根(P<0.05)。到10月狗牙根芽内的活性明显下降，C133SOD活性最低为31.177 μ/gfW，略低于其他品种，新农3号芽内酶活性降低到32.020 4 μ/gfW，C48SOD活性均高于其他品种为89.232 μ/gfW。狗牙根芽体SOD活性有所上升，SOD活性减少，狗牙根已进入休眠期，直到细胞膜失去活性，茎叶死亡。图3

2.3.2 过氧化物酶(POD)活性

比较狗牙根芽内3个不同生长时期内POD活性值，其变化趋势与SOD相似，先升高后降低，但降低后的活性值大体上高于8月的活性。8月C39的POD活性显著低于其他地区狗牙根为908.854 U-1min-1(P<0.05)，C45的POD活性最强为2 407.75 U-1min-1。9月POD活性值升高，其中C48的POD活性较低为1 243.56 U-1min-1，C39芽内酶活性增加到2 355.5 U-1min-1，C45芽内POD活性增加到2 545.71 U-1min-1，新农1号的POD活性显著高于其他地区狗牙根值为3 608.58 U-1min-1。到10月呈下降趋势，新农1号POD活性值降为1 321.5 U-1min-1，C45降到1 608.469 5 U-1min-1，C39降低到1 854.99 U-1min-1。图4

图3 不同时间段SOD活性比较Fig.3 Comparison of SOD activities in different time interval

2.4 丙二醛(MDA)含量

研究表明，在8、9月，新农1号MDA含量最低为0.004 μmol/g，C133的MDA含量值显著高于其他狗牙根为0.010 μmol/g(P<0.05)，其次是C66，其活性值为0.008 μmol/g。9月这些地区狗牙根(C45、C48、C66、新农1号、新农3号)芽内MDA含量上升，膜质抗氧化能力偏弱。在未进入休眠之前，各种狗牙根芽体内的MDA含量基本保持稳定，属于较高的水平，不同材料在2个月之间呈现出差异，但差异不显著(P<0.05)。

10月后，狗牙根芽内的MDA含量值均降低，显著低于8和9月的含量值，新农1号芽内MDA含量降低至0.001 μmol/g，C133芽内MDA含量降到0.003 μmol/g。其中C48最低为0.001 μmol/g。图5

图4 不同时间段POD活性比较Fig. 4 Comparison of POD activities in different time interval

图5 不同时间段MDA含量的比较Fig. 5 Comparison of MDA content in different time interval

3 讨 论

目前，已有大量的研究发现，植物芽休眠进程与脯氨酸、抗氧化酶、可溶性蛋白等生理物质的变化密切相关[10-13]。但这些生理物质的变化规律却不尽一致，不同物质响应的规律有差异。

植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，把脯氨酸含量变化作为抗胁迫的重要生理指标。在植物休眠的进程中，发现低温往往是与休眠相伴，在狗牙根中低温是诱导休眠的关键因素。在逆境条件下(旱、盐碱、热、冷、冻)植物体内脯氨酸的含量显著增加[14,15]。郑小林等[16]研究结果认为，假俭草经过低温处理后，叶片的游离脯氨酸随温度的降低而大量累积。王洪春[17]研究认为，草坪草在低温下游离脯氨酸的大量积累是对低温胁迫的一种适应性反应。黄锦文等[18]发现在低温胁迫下，沟叶结缕草和结缕草体内脯氨酸含量都极显著递增；陈登文等[10]发现，在杏枝芽休眠期间，脯氨酸随着低温需求量的增加，会出现增加趋势，脯氨酸含量与低温需求量存在着相关关系。试验与该研究相一致，10月缓慢进入低温阶段，狗牙根芽中脯氨酸含量达到最大值，由于低温影响，狗牙根准备进入休眠阶段，脯氨酸的积累可以帮助机体度过低温逆境。

植物进入休眠后，芽体内水分含量及存在状态、膜透性、可溶性蛋白、碳水化合物、脯氨酸等含量均发生显著变化。于芹[13]研究油桃芽体随自然休眠诱导进程的发展，发现9月底10月初，休眠诱导后期芽体总含水量逐渐下降并稳定在较低的水平，芽体开始进入自然休眠期。芽体MDA含量均呈下降趋势，花芽中降幅较大。芽体可溶性蛋白和脯氨酸含量随着休眠诱导进程的发展呈上升趋势。研究结果也显示，随着温度降低，狗牙根进入休眠，芽体内的可溶性蛋白也随之升高，低温环境对狗牙根造成一定的伤害，因此，体内可溶性蛋白大量积累以减少低温对机体的伤害，持续降温，狗牙根会进入休眠状态以度过低温阶段。

多项研究表明，POD、SOD等是植物体内的保护酶系统，它们之间相互协调，共同协作，清除膜脂过氧化过程中产生的活性氧[19,20]。多项研究表明，SOD、POD活性与休眠进程相关，敏感响应期约在进入休眠诱导期的前1周[12]。暖季型草坪草在受到低温胁迫时，体内保护酶系统会提高酶活性，帮助机体度过逆境，长期的低温影响会使狗牙根进入休眠状态，其酶活性也会随之降低。研究中也发现，SOD在狗牙根进入休眠后保持较低水平，与未休眠前相比较，明显降低，而且该指标在不同狗牙根材料中的表现比较一致。而对于POD酶，休眠前后也有波动，在休眠中比较稳定。

MDA含量是植物细胞膜质过氧化程度的体现，一般植物在逆境条件下就会产生膜质过氧化。毕磊研究梨花芽休眠特性及解除休眠，表明MDA含量自然休眠期间下降。范克欣[11]研究表明，油桃休眠期间花芽内MDA含量在休眠初期持续上升，在深休眠期降低并一直保持较低水平。进入休眠后，膜质过氧化程度加重，MDA含量降低。研究中，狗牙根芽在休眠阶段MDA含量显著降低，该指标对于发现狗牙根进入休眠的进程具有指示作用，可以作为狗牙根芽进入休眠的判定指标。

4 结 论

狗牙根芽体内的脯氨酸大体上随休眠进程的深入而升高，到10月，由于低温影响，狗牙根已经完全进入休眠阶段，脯氨酸的积累可以帮助机体度过低温逆境。狗牙根在休眠阶段中，芽体内可溶性蛋白大量积累。狗牙根芽体SOD活性有所上升，其原因可能是自身为了防御低温，狗牙根即将进入休眠时做出的应对反应。SOD活性减少，狗牙根已进入休眠期，直到细胞膜失去活性，茎叶死亡。C130的POD活性值相对于其他地区狗牙根芽内酶活性较高为2 059.26 U-1min-1不同的材料之间，芽体的膜质抗氧化能力不同，芽体内的细胞大多发生了膜脂过氧化，膜的通透性进一步降低，生理生化反应几乎停滞，狗牙根已经进入休眠。

狗牙根芽休眠进程与脯氨酸、抗氧化酶、可溶性蛋白等生理物质的变化密切相关，狗牙根芽随着温度的降低，逐渐进入休眠，脯氨酸、可溶性蛋白含量在大量积累，SOD、MDA含量下降，保持较低水平，可将游离脯氨酸和可溶性蛋白大量升高作为参考指标判定休眠的起始。