HBV相关肝细胞癌患者经长期核苷(酸)类药物抗病毒治疗后HBV RNA的表达水平及临床意义

李 静， 曹 宇， 冯永美， 郭远强， 蒋 贝， 王春妍

1 天津医科大学 研究生院， 天津 300192； 2 天津市第二人民医院 a.科研室， b.肝病科， 天津 300192；3 南开大学 药学院， 天津 300192

HBV感染仍然是一个严峻的全球性的健康问题，是导致肝衰竭、肝硬化、肝细胞癌(HCC)的重要危险因素。乙型肝炎病情的慢性化以及进展主要与HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)有关[1]。血清中的HBV RNA主要是3.5 kb的HBV RNA preC mRNA和pgRNA，其本质是前基因组RNA，只能转录自cccDNA[2-3]。Giersch等[4]研究证明pgRNA与cccDNA存在强相关性。HBV pgRNA可以反映肝细胞内cccDNA 的真实存在水平和转录活性[4-5]。HBV pgRNA的水平受核苷(酸)类似物(NAs)的影响较小，在长期接受抗病毒药物治疗患者的临床检测中更具有指导意义。Halgand等[6]研究提示pgRNA是病毒复制和预后的敏感标志物。故此，本研究拟针对HBV相关HCC患者长期应用NAs治疗后，高敏HBV DNA低于检测下限，进行HBV RNA检测水平及意义分析，以期寻找长期NAs抗病毒治疗，HBV DNA低于检测下限，疾病进展可能原因。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2019年6月—2020年8月天津市第二人民医院收治的HBV相关HCC患者。所有病例诊断均符合《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[7]，至少2年NAs抗病毒治疗，至少2次间隔3个月经罗氏试剂检测高敏HBV DNA检测小于20 IU/mL，排除其他肝炎病毒、酒精性肝炎、自身免疫性肝病、遗传代谢性肝病所致肝癌患者。所有HCC患者均经过手术切除、消融、介入或分子靶向药物治疗，再次或反复出现肿瘤复发或新发。

1.2 检测方法 HBV DNA定量检测试剂购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，检测采用荧光定量PCR法，检测下限为20 IU/mL。HBV RNA定量检测试剂购自中国湖南圣湘生物科技有限公司，检测下限为100 IU/mL。HBV血清标志物采用化学发光法检测，试剂购自雅培医疗(上海)有限公司。肝功能检测使用日本日立7180自动生化仪。

1.3 伦理学审查 本研究经天津市第二人民医院医学伦理委员会批准，批号：津二人民伦审字[2018]15号。

2 结果

2.1 一般情况 共纳入患者60例，其中男47例，女13例，年龄32～79岁(表1)。

表1 入组患者一般资料

2.2 AFP不同水平HBV RNA定量比较 根据AFP水平不同，分为AFP阳性组及AFP阴性组，两组HBV RNA水平分别为0(0～3.57)、0(0～2.00)，差异无统计学意义(Z=-1.474，P=0.141)。

2.3 BCLC不同分期HBV RNA定量比较 根据BCLC分期不同，分为BCLC A期、B+C+D期，两组HBV RNA水平分别为0(0～2.0)、0(0～2.0)，差异无统计学意义(Z=-0.607，P=0.544)。

2.4 HBeAg不同水平HBV RNA定量比较 根据HBeAg水平不同，分为HBeAg阳性组和HBeAg阴性组，两组HBV RNA水平分别为2.99(0～4.80)、0(0～0.50)，差异有统计学意义(Z=-3.400，P=0.001)。

2.5 HBsAg不同水平HBV RNA定量比较 根据HBsAg水平不同，分为A、B、C 3组，分别为HBsAg≤100 IU/mL、100 IU/mL

2.6 相关分析 分别以年龄、ALT、AST、GGT、ALP、HBsAg、HBeAg、AFP值作为自变量，血清中HBV RNA水平作为因变量，进行相关分析， HBsAg滴度与HBV RNA水平相关(r=0.292，P<0.05),其余无相关性(P值均>0.05)。

3 讨论

NAs对cccDNA无直接抑制和清除作用[8]，即使能快速有效抑制HBV DNA低至检测下限，肝脏中存在的cccDNA仍在影响病毒的复制[9]，使得NAs长期治疗的患者仍有一部分会发展至终末期肝病，甚至肝癌[10]。

本研究发现，在60例HBV相关HCC经长期抗病毒治疗患者中，HBV RNA检测阳性者9例，占比15%。提示在HBV DNA低于检测下限后，仍存在部分患者HBV RNA阳性，应进一步追求血清中HBV RNA低于检测下限作为病毒学应答指标。

HBeAg是由C区的前C基因编码而来，HBeAg阳性通常被认为具有高感染性。本研究入组HBeAg阴性患者46例，HBV RNA阳性2例(4.3%)；HBeAg阳性患者14例，HBV RNA阳性7例(50.0%)，且HBV RNA水平更高(Z=-3.400，P=0.001),差异有统计学意义。但Pearson相关分析提示，HBV RNA水平与HBeAg水平没有相关性。分析HCC患者已处于肝病终末期，经长期抗病毒治疗后，HBV DNA定量低于检测下限，大多数患者已出现HBeAg血清学转换；或者可能出现PreC区和基本核心启动子区频繁突变，HBeAg减少或完全丧失，故此HBeAg滴度高低可能与HBV RNA水平无明显相关性。

HBsAg是HBV感染的传统血清学标志物，HBsAg阴转被认为临床治愈[8]。HBsAg的持续存在是慢性乙型肝炎患者发展为肝硬化和HCC的危险因素。当血清中HBV DNA低于检测下限时，HBsAg完全由cccDNA编码而来，而HBV RNA为cccDNA的转录产物。故此，本研究深入分析HBV RNA水平与HBsAg之间的关系，发现不同HBsAg组间HBV RNA定量差异有统计学意义。Pearson相关分析提示，HBV RNA滴度与HBsAg水平具有相关性(r=0.292，P<0.05)。血清HBsAg滴度越高，HBV RNA水平越高，肝内cccDNA水平高，预示病毒转录状态活跃，可能更易出现肿瘤，病情进展。

本研究也发现，AFP水平与HBV RNA水平无关。HCC早期患者与其他各期相比，HBV RNA水平没有差异，提示HBV RNA水平对于HCC的诊断及疾病所处状态没有预测价值。

由于HBV RNA检测在临床中尚未广泛应用，检测试剂尚未标准化，本研究尚存在一定的局限性。后续研究拟入组初次发现肝脏肿瘤患者，经过根治治疗，随访2～3年，以观察HCC患者生存期、肿瘤复发/新发与HBV RNA之间的关系。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：李静负责收集整理资料，撰写论文；曹宇负责实验操作；冯永美负责统计分析；蒋贝负责患者入组及筛选；郭远强负责分析、解释数据；王春妍负责指导撰写文章，修改论文。