不同类型杀菌剂对解淀粉欧文氏菌室内毒力测定

陈 伟，段红雁，李紫英，郝海婷，王 兰

(塔里木大学植物科学学院/南疆农业有害生物综合治理兵团重点实验室/农业部阿拉尔作物有害生物科学观测实验站/南疆特色果树高效优质栽培与深加工技术国家地方联合工程实验室，新疆阿拉尔 843300)

0 引 言

【研究意义】解淀粉欧文氏菌是引起梨、苹果、山楂、火棘等蔷薇科植物细菌性病害的一种病原细菌，可以侵染40余属的220种植物[1-2]。防治细菌的主要手段是改良品种和使用农药。改良品种的周期长，农药的作用靶标单一，筛选新的杀菌剂类型迫在眉睫[3]。【前人研究进展】王雪等[4](2012)研究结果显示，抗生素类杀菌剂，无机类杀菌剂对其供试细菌有抑菌效果；梁慧敏等[5](2019)研究结果显示，内吸性杀菌剂、有机类杀菌剂、植物源类杀菌剂、微生物杀菌剂均对解淀粉欧文氏菌有抑菌效果，但同时参与药剂筛选的多种抗生素抑菌效果不好。【本研究切入点】研究解淀粉欧文氏菌毒力较强的杀菌剂种类，筛选高效防病药剂。【拟解决的关键问题】以解淀粉欧文氏菌为研究对象，采用最低抑制浓度法在10种杀菌剂中筛选，采用抑菌圈实验，筛选出对解淀粉欧文氏菌有良好抑菌效果的杀菌剂类型，为解淀粉欧文氏菌引起病害的化学防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

解淀粉欧文氏菌模式菌株 NCPPB1665，由南京农业大学胡白石教授赠。

1.1.2 主要试剂

供试杀菌剂共10种，包括有机杂环类杀菌剂3%噻霉酮微乳剂和12%噻霉酮水分散粒剂、抗生素类杀菌剂6%中生菌素水剂和0.15%四霉素水剂、噻唑类杀菌剂20%噻唑锌悬浮剂、微生物杀菌剂多黏芽孢杆菌、铜制剂20%噻菌铜悬浮剂、30%噻森铜悬浮剂、33.5%喹啉铜悬浮剂、46%氢氧化铜水分散粒剂。表1

表1 供试杀菌剂Table 1 Bactericide tested

1.2 方 法

1.2.1 培养基、培养条件及菌悬液的制备

营养琼脂培养基NA：牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂17 g，加无菌水至1 L，调pH至7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。供试菌在NA固体培养基上28℃恒温过夜培养。用无菌接种环刮下培养好的菌苔转入含无菌水试管中，重悬，根据菌种在600 nm的吸光度值与菌液浓度之间的线性关系(y=0.115ln(x)-1.90[6])用分光光度计调至OD600达0.2，此时菌悬液浓度为108CFU/mL。

1.2.2 杀菌剂最低抑制浓度的筛选

采用含毒介质-最低抑制浓度法[7]获取利用解淀粉欧文氏菌株NCPPB1665进行药剂最低抑制浓度的初筛。按照各药剂的使用说明书对每种药剂进行浓度梯度稀释，初试在不同浓度下各药剂的抑菌效果，取5个不同的药剂浓度进行最低抑菌浓度测定，每个浓度至少3个重复。将供试的农药制剂配制成浓度为50 mg/mL的药剂母溶液，待灭菌的营养琼脂培养基温度降至55℃左右时，加入一定体积药液，混合均匀即制备成一定工作浓度的含药剂培养基。用移液器将0.5 μL菌悬液接种于培养基上，每个皿上按3个方位点接种3点，对照用相同体积的菌液接种未加药剂的培养基作对照，重复3次。培养基置于28℃恒温培养箱中培养48 h，观察记录菌落生长情况。

未能辨别出接菌点或有接菌点但干缩的，菌落生长受抑制，以“-”表示;菌点能够生长并保持湿润，以“+”表示。记录每种药剂在每个浓度下菌落不能生长的最低药剂浓度标记为C-，根据式C'=(C++C-)/2，计算实验中的最低抑菌浓度C'，3次实验结果的均值代表该药剂最低抑菌浓度。

1.2.3 抑菌圈法

将已熔化NA培养基冷却至45℃，倒在9 cm培养皿中，每皿15 mL，加入培养好的供试菌悬液100 μL，充分摇匀使其均匀铺平，冷却。用6 mm打孔器呈等边三角形状打孔，将配制好的药液用移液枪平稳的打入孔内，每孔10 μL。以无菌水为空白对照，每皿1个处理，倒置在28℃培养箱中培养36 h，重复3次。采用十字交叉法测定抑菌圈直径(mm)，并以药剂浓度的对数为自变量，抑菌圈的平均直径(mm)为因变量，求出毒力回归方程，并以使抑菌圈直径达到一定值(试验以6 mm为基准)时的杀菌剂有效浓度进行毒力比较，按式(1)计算杀菌剂对菌丝生长的抑菌率[8-9]。

抑菌率=[(处理组直径-对照组直径)/(处理组直径)]×100%。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel和DPS7.05软件对数据进行处理分析。将抑菌率换算成抑制几率值，药剂质量浓度转化为对数值，并用回归法求毒力回归方程和相关系数，计算EC50值。

2 结果与分析

2.1 杀菌剂对解淀粉欧文氏菌株 NCPPB1665的最低抑制浓度筛选

研究表明，在参试的10种杀菌剂中有8种对菌株NCPPB1665有抑制作用，有机杂环类中最小抑制浓度3.63(3%噻霉酮)<4.38(12%噻霉酮)，抗生素类中最小抑制浓度6.25(6%中生菌素)小于8.75(0.15%四霉素)，噻唑类最小抑制浓度81.25(20%噻唑锌)，微生物制剂最小抑制浓度562.5(多粘类芽孢杆菌5亿活芽孢每克)，铜制剂中最小抑制浓度175(20%噻菌铜)<325(46%氢氧化铜)。每种杀菌剂种类中最低抑制浓度最小的药剂，即3%噻霉酮微乳剂(有机杂环类)、6%中生菌素可溶液剂(抗生素类)、20%噻唑锌悬浮剂(噻唑类)、多黏芽孢杆菌5亿活芽孢/g(微生物制剂)、20%噻菌铜悬浮剂(铜制剂)。表2

表2 8剂对供试细菌NCPPB1665最低抑菌浓度Table 2 Minimum inhibitory concentration of 8 agents against tested bacteria ncppb1665

2.2 不同杀菌剂对解淀粉欧文氏菌株 NCPPB1665 的毒力测定

研究表明，不同种类杀菌剂对解淀粉欧文氏菌株NCPPB1665的毒力作用中，有机杂环类制剂相比其他种类药剂有效质量浓度是最低，使用同等剂量时该种类制剂具有较强的抑菌作用；抗生素类制剂需要的有效质量浓度低于噻唑类制剂和铜制剂的有效质量浓度，显示使用同等剂量下，抗生素类制剂具有较强的抑菌作用；微生物制剂在5种类型杀菌剂中抑菌作用稍弱，其有抑菌作用但使用浓度高、抑菌效果较差。

不同种类的参试杀菌剂在供试各浓度下均对模式菌株NCPPB1665具有明显的抑菌作用。所检测制剂中对解淀粉欧文氏菌菌株NCPPB1665具有最好抑菌作用的是有机杂环类制剂、抗生素类制剂，毒力最高，EC50值分别为43.148和87.82 mg/L，其余药剂按毒力大小排序为噻唑类>微生物类>铜制剂类。表3

表3 各药剂类型室内毒力测定抑菌效果对比Table 3 Comparison of bacteriostatic effect of different types of bactericide

3 讨 论

解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)是一种引起毁灭性病害的植物病原细菌，主要危害仁果类果树和蔷薇科植物。该菌自19世纪末首次发现[10-12]。

研究采用了室内离体抑菌活性的方法评价了5大类杀菌剂对解淀粉欧文氏菌的抑制作用，明确了机杂环类、抗生素类、噻唑类、微生物菌剂和铜制剂等5种类型的杀菌剂对解淀粉欧文氏菌的抑菌效果。

有机杂环类杀菌剂又称异噻唑啉酮类衍生物,对细菌、真菌均有较强的抑制毒杀作用，是一种新型、广谱杀菌剂。大量研究表明[13-16]，有机杂环类杀菌剂对细菌、真菌病害都有明显的防治效果，与研究相符，研究中其对解淀粉欧文氏菌的毒力最高，EC50为43.158 mg/L，高于其他种类杀菌剂。

铜制剂作为一种广谱杀菌剂，对众多作物的细菌性病害均有突出的防治效果，大量研究表明[17-20]，铜制剂杀菌剂在田间对细菌性病害有较高的防效，研究采用抑菌圈的方法，得到的结果显示，铜制剂杀菌剂对解淀粉欧文氏菌的抑菌效果较差，而铜制剂的作用机理是，依靠植物表面水的酸化，逐步释放铜离子，与病菌的蛋白质结合，使其蛋白酶变性而死亡，抑制病菌萌发和菌丝发育，铜制剂的杀菌作用取决于制剂释放的铜离子浓度，在试验中较高浓度下表现出抑菌活性，较低浓度下缺少植物表面水的酸化表现较低活性。

4 结 论

有机杂环类杀菌剂对解淀粉欧文氏菌的室内药效最强，对应药剂EC50值为43.148 mg/L，其后按EC50值由小到大的排序为抗生素类杀菌剂、噻唑类杀菌剂、微生物杀菌剂和铜制剂杀菌剂，对应药剂EC50分别为87.82、469.50、4 397.20和4 782.00 mg/L。

5种类型杀菌剂对解淀粉欧文氏菌均有一定的活性，且抑菌效果差别较明显。其中有机杂环类和抗生素类抑菌效果较好，其次为噻唑类和微生物菌剂抑菌效果，而铜制剂的毒力测定最差。