A型产气荚膜梭菌感染绿壳蛋鸭的病理发生学研究

蔡海情，吕绍亮，袁盛林，文 明，2，3*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州大学动物疫病研究所，贵州 贵阳 550025；3. 贵州省动物生物制品工程技术研究中心，贵州 贵阳 550025)

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)又称魏氏梭菌，由美国病理学家W.H.韦尔奇等于1892年从死亡动物尸体中分离鉴定并命名[1]。产气荚膜梭菌在自然界分布广泛，存在于土壤、污水、动物和人的肠道及粪便中，是1种人畜共患病原菌。根据产生主要毒素(α、β、ε、ι、NetB、CPE)的不同，分为7种类型(A～G型)[2]。产气荚膜梭菌能分解动物肌肉组织和结缔组织中的糖类，产生大量气体导致组织气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，从而引起动物胃肠道疾病(坏死性肠炎、肠出血症等)，特别是感染家禽后，可造成养禽业的重大经济损失，成为危害家禽养殖产业健康发展的重要病原之一[3～5]。张彤宇等[6]研究表明，华东部分地区水禽感染A型产气荚膜梭菌的阳性检出率高达68.75%，且水禽只携带A型产气荚膜梭菌。相关研究在对雏鸭感染鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)后检测其肠道菌群多样性时发现，随着感染时间的增加，种间菌群相当丰富度中产气荚膜梭菌的丰富度逐渐升高[7]，而二者在引起的组织病变上存在相似之处，所以推测该菌在DEV感染雏鸭后期对病程发展存在助推作用。有文献报道山东省4个鸭场均检测出A型产气荚膜梭菌[8]，但依旧无法明确解释A型产气荚膜梭菌感染与DEV之间共感染的关系。本试验开展A型产气荚膜梭菌感染鸭的病理发生学研究，以明确该菌对鸭的感染性，及感染后各组织的病变特征和发展规律，为阐明A型产气荚膜梭菌感染鸭的相关作用机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物、菌种及试剂1日龄健康清洁级绿壳蛋鸭30只(购自贵州省贵阳绿源禽业有限公司)；A型产气荚膜梭菌菌种、1%葡萄糖鲜血培养基(贵州大学动物疫病研究所惠赠)；液体硫乙醇酸盐培养基(FT)(购自杭州微生物试剂有限公司)。

1.2 主要仪器单人双面净化工作台(型号SW-CJ-1F，苏州安泰空气净化设备有限公司)、隔水式电热恒温培养箱(型号QYC-2012C，上海贺德实验设备有限公司)、台式高速冷冻离心机(型号G2235 110134，丹麦 LABOGENE公司)、包埋机(型号JB-P5，武汉俊杰电子有限公司)、病理切片机(型号RM2016，上海徕卡仪器有限公司)、光学显微镜(日本 OLYMPUS公司)、恒温摇床(型号HZQ-X100，上海豫明仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 试验分组将30只1日龄健康雏鸭按试验要求饲养至30日龄后，随机分为对照组和试验组(分组后再适应性饲养7 d)，每组15只。人工感染分3个时段(96、120、144 h)，每时段各5只。

1.3.2 菌种复苏与增菌将-20 ℃保存的A型产气荚膜梭菌菌种取出并恢复至室温(25 ℃)，取菌液1 mL于无菌FT液体培养基中，50 r/min 37 ℃恒温培养12 h后，用麦氏比浊法调整菌液浓度为1.0×108CFU/mL，每日培养的菌液限当日使用。

1.3.3 人工感染、临床症状观察与组织样品采集试验组雏鸭用A型产气荚膜梭菌菌液灌喂，2次/d，每次8 mL/只，2次灌喂之间隔6 h，每次灌喂前、后禁水、禁食2 h(对照组用生理盐水做同样处理)，连续灌喂4 d，每隔6 h观察1次雏鸭的精神、采食、饮水、粪便情况并记录。分别在感染96、120、144 h后解剖并观察雏鸭组织病变，对病变部位、渗出液进行细菌分离培养，并采集十二指肠、空肠、回肠组织样品置于4%多聚甲醛中固定12～24 h。

1.3.4 组织病理切片制作将采集的组织从固定液中取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整后用流水冲洗12 h，经梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片和脱蜡。具体操作过程：(1)脱水与透明。将流水冲洗好的组织取出并放入75%乙醇溶液中脱水10 min→80%乙醇溶液脱水10 min→95%乙醇溶液Ⅰ脱水10 min→95%乙醇溶液Ⅱ脱水15 min→100%乙醇溶液Ⅰ脱水10 min→100%乙醇溶液Ⅱ脱水10 min→二甲苯溶液Ⅰ透明30 min→二甲苯溶液Ⅱ透明30 min。(2)浸蜡与包埋。将已被二甲苯透明处理的组织放入融化的石蜡中，45 min左右后取出，放入包埋盒中并用加热的镊子调整位置，排出其中的小气泡，将包埋盒放置于冷凝板上，待其完全凝固成块前将预先准备好的标签插入其中，凝固好后将蜡块取出常温保存。(3)切片。将取出的蜡块用刀片修整为规整的方形，在连续切片机上切成厚度为5 μm的蜡带。(4)贴片与烤片。将蜡带用毛笔轻托置于水温为39 ℃的展片机中，待其展平后捞至涂抹薄层蛋白甘油的洁净载玻片上铺平(注意铺平位置要控制好)，随后用滤纸吸去多余水分后置于60 ℃的烤片机上烘干。(5)脱蜡。将石蜡切片置于二甲苯溶液Ⅰ20 min→二甲苯溶液Ⅱ20 min→100%乙醇溶液Ⅱ10 min→100%乙醇溶液Ⅰ10 min→95%乙醇溶液Ⅱ5 min→95%乙醇溶液Ⅰ5 min→85%乙醇溶液5 min→70%乙醇溶液5 min→流水冲洗3 min。(6)染色。将上述流水处理后的切片进行HE染色与固定，用苏木素染色40 min→微流水冲洗2 min→1%盐酸水溶液分化5～10 s(可观察到切片由蓝变红)→流水缓慢冲洗返蓝5～10 min→0.5%伊红水溶液染色0.5～1 min→中性树胶封片(注意将载玻片背侧伊红溶液擦干，滴上树胶后盖玻片从一侧放入，避免产生气泡)→显微镜镜检，图像采集分析。

2 结果

2.1 人工感染雏鸭症状及病变观察对雏鸭连续灌喂A型产气荚膜梭菌菌液72 h后开始出现腹泻症状，但精神、采食、饮水未表现异常。96 h后雏鸭出现精神萎靡、羽毛凌乱、采食下降、腹泻症状加重、饮水增加的情况；解剖观察发现雏鸭部分组织间有纤维素性渗出液。120 h后雏鸭出现反应迟钝、扎堆、采食饮水下降、粪便变为褐色的情况；解剖观察发现纤维素性渗出加重，部分组织伴有出血点和坏死，十二指肠、空肠、回肠有明显的臌气和出血点。144 h后雏鸭出现死亡；解剖发现十二指肠、空肠、回肠出现坏死。灌喂生理盐水的对照组未表现异常。

2.2 病变组织细菌分离培养鉴定将纤维素性渗出液、严重病变组织用接种环无菌接种于1%葡萄糖鲜血培养基，50 r/min 37 ℃恒温培养12 h，出现圆形、凸起、光滑、灰白色、边缘整齐的菌落(见图1)；革兰氏染色镜检为革兰氏阳性菌，呈细直杆状，两端钝圆(见图2)，与人工感染的A型产气荚膜梭菌相同。

图1 培养菌落

图2 革兰氏染色菌体

2.3 组织病理切片观察对雏鸭连续灌喂A型产气荚膜梭菌菌液144 h后，引起十二指肠、空肠、回肠不同程度的病变：十二指肠肠腔充满变性、脱落、坏死的上皮细胞，肠绒毛发生崩解脱落，并有血细胞和少量炎性细胞浸润，间杂大量淋巴细胞(见图3A、B)；回肠绒毛总体结构较为完整，但部分肠绒毛发生断裂，并伴有充血现象(见图3C、D)；空肠肠腔充满变性、脱落、坏死的上皮细胞，肠绒毛发生崩解脱落，并有血细胞和少量炎性细胞浸润，肌纤维间隙较大、断裂、密度明显减小(见图3E、F)。对照组肠组织切片正常(见图4 A、B、C、D)。

A B

C D

E FA、B：十二指肠； C、D：回肠； E、F：空肠图3 试验组肠组织病理切片

A B

C DA、B：十二指肠； C：回肠； D：空肠图4 对照组肠组织正常切片

3 结论

本试验结果发现，A型产气荚膜梭菌会在鸭肠道内产生气体，引起十二指肠、空肠、回肠不同程度的病变，感染144 h后最为严重。病理变化主要为：十二指肠肠腔上皮细胞变性和坏死，肠绒毛发生崩解脱落，并有血细胞和少量炎性细胞浸润，间杂大量淋巴细胞；回肠绒毛发生断裂，并伴有充血现象；空肠肠腔充满变性、脱落、坏死的上皮细胞，肠绒毛发生崩解、脱落，并有血细胞和少量炎性细胞浸润，肌纤维间隙增大、断裂、密度明显减小；十二指肠、空肠、回肠黏膜出现轻微溃疡灶，发生肠毒血症、坏死性肠炎。

4 讨论

正常情况下，肠道菌群之间、菌群与宿主之间处于动态平衡，从而维持肠道的正常生理功能[7]。当动物机体受到病原微生物侵袭时，肠道菌群动态平衡被破坏，导致肠道有益菌数量减少而有害菌数量增多，同时引起宿主免疫功能下降，从而造成疫病的发生和病情的加重[9，10]。研究发现，产气荚膜梭菌感染鸡后可在小肠段大量增殖并分泌外毒素，导致肠道发生病理性损伤，进而引发坏死性肠炎[11]；急性病例的病理变化表现为出血性黏膜溃疡或严重黏膜坏死，从而引发较高的死亡率[12]；慢性病例的病理变化表现为十二指肠、空肠和回肠黏膜的轻微溃疡灶，从而导致营养物质消化吸收不良和饲料转化效率降低，严重影响家禽生产性能[13，14]。此外，DEV感染后，鸭肠道中产气荚膜梭菌和坏死梭杆菌均呈先下降后升高趋势[15]。DEV感染鸭的主要病变为血管损伤和消化道黏膜出血、坏死，推测与产气荚膜梭菌和DEV含量升高存在一定的关联，这有待于进一步实验验证。