淫羊藿黄酮对慢性脑缺血低灌注致大鼠脑白质病变的影响

张 丽 王明洋 牛红妹 张 兰 李 林

(首都医科大学宣武医院药学部 北京市神经药物工程技术研究中心 北京脑重大疾病研究院 神经变性病教育部重点实验室，北京 100053)

脑小血管病(cerebral small vascular disease, CSVD)是一类病理改变主要累及颅内小血管的疾病，临床主要表现为脑卒中、认知功能障碍、精神异常等[1]。随着社会人口老龄化的加剧，该病发病率日趋增高，且有研究[2]显示CSVD可使脑卒中发病的风险增加2～10倍，诱发36%～67%痴呆患者发病，是引起脑卒中和血管性痴呆的主要原因[3-4]。脑白质损伤是CSVD引起病理变化的主要亚型，也是最常见典型的病理表现[5]。与CSVD相关的白质损害被认为是由慢性低灌注引起的，可导致认知障碍[6]。CSVD直接或间接诱发继发性病变，威胁患者的健康和生活质量，给患者和社会带来巨大的经济负担。因此，目前迫切需要开发治疗CSVD的有效药物。

淫羊藿黄酮(epimedium flavanoids, EF)是从淫羊藿中提取的主要成分，具有延缓衰老、调节免疫、抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴的作用[7-8]。前期研究[9]显示EF可改善神经细胞β-淀粉样前体蛋白[myloid beta(A4)precursor protein, APP]转基因小鼠的学习记忆障碍，改善双环己酮草酰二腙(cuprizone,CPZ)诱导的脑白质病变小鼠模型的神经功能损伤，而EF是否能通过减轻白质损伤改善慢性低灌注引起的认知功能障碍，从而达到治疗CSVD的目的尚未可知。本研究采用双侧颈总动脉结扎模型大鼠模拟CSVD的慢性脑缺血低灌注病理状态，采用影像学及组织化学方法观察EF对白质损伤的影响，为研制能够改善认知功能障碍的新型抗CSVD药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

淫羊藿黄酮(epimediun flavanoids, EF)，由江苏康缘药业有限公司提供。尼莫地平片(nimodipine)，购自正大青春宝药业，羧甲基纤维素钠、蔗糖、多聚甲醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等购于北京法杰德化学试剂公司。

1.2 实验动物

无特定病原体级(specific pathogen free, SPF) SD雄性大鼠，体质量280～300 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：11400700139347。实验动物伦理编号：AEEI-2018-132。饲养于首都医科大学宣武医院SPF级动物房，适应性饲养1周后进行正式实验。饲养温度恒定为(22±3) ℃，相对湿度恒定为60%±5%，12 h光照/12 h黑暗循环，自由进水及饲料。

1.3 动物分组及处理

采用数字表法将大鼠随机分为5组，每组7只：假手术组(sham)，模型组(model)，100 mg/kg EF给药组[model+EF(L)]，200 mg/kg EF给药组[model+EF(H)]，阳性药尼莫地平组(model+nimodipine，10 mg/kg)。双侧颈总动脉结扎术(permanent bilateral common carotid artery ligation, 2VO)术后24 h灌胃给药，每天固定时间1次，连续给药6周，sham、model组给予等体积的0.5%(质量分数)羧甲基纤维素钠。

1.4 模型制备

将SD大鼠深度麻醉后，行2VO,四肢固定在木板上,通过颈部腹侧切口将双侧颈总动脉与颈部交感神经和迷走神经分离，然后用5.0丝线结扎颈总动脉。假手术组除了没有结扎颈颈总动脉外，其他操作与手术组相同。在整个实验过程中，维持大鼠的体温一直保持在37 ℃左右，缝合皮肤后，将大鼠放回笼子，待苏醒后正常喂养。

1.5 新物体识别实验

采用新物体识别实验来评价2VO大鼠的物体分辨能力，以物体分辨指数(discrimination index, DI)为检测指标，反映大鼠胼胝体部位相关的空间记忆能力，从而反映大鼠的认知能力。给药结束后(造模后43 d)进行新物体识别实验行为学测试，参照Ma等[10]的实验方法，主要分为3个阶段进行实验。具体操作步骤：第1天为适应期：将大鼠放于均匀光照的正方形木箱中，其尺寸为100 cm ×100 cm×100 cm(长×宽×高),自行适应性活动10 min。第2天为熟悉期：在正方形木箱中放入2个相同的圆柱体(直径为5 cm，高为5 cm)，圆柱体置于正方形木箱斜对角线的1/3处，将大鼠放于反应箱中自行活动10 min，记录其在10 min内对每个圆柱体的探索时间(以大鼠的嘴凑近圆柱体<0.5 cm，方向必须对着该圆柱体才计入探索时间，站在圆柱体上等不计入时间)。第3天为识别期：放入新的一个立方体(高为5 cm，直径为5 cm)替换其中的一个圆柱体，分别记录大鼠在10 min 内探索圆柱体和立方体的时间。计算各组大鼠第3天的分辨指数，数值越大，反映实验动物空间记忆能力越好。计算公式为：

1.6 磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)检测方法

各组大鼠(n=3)分别于行为学实验结束后(造模后47 d)进行小动物核磁扫描。大鼠磁共振检测在首都医科大学实验中心影像教研室完成。用快速自旋回波脉冲序列进行弥散张量成像(diffusion tensor imaging, DTI)，检测脑白质胼胝体和视束部位微观结构的改变。应用MRI-DTI观察大鼠脑白质纹状体断面胼胝体部位轴突与髓鞘结构的改变。大鼠经JD医用麻醉系统吸入2.5%(体积分数)异氟醚进行麻醉，待麻醉成功后，取俯卧位，头置于线圈中央，采用7.0T小动物专用核磁扫描仪进行大鼠全脑扫描，维持大鼠体温在37 ℃。DTI扫描参数为：TR 18 000 ms，TE 25 ms，MTX128×128，FOV:3 cm×3 cm,t=8 min, 层厚：2 mm。利用Paravision version 5.1软件获得分数各向异性(fractional anisotropy, FA)、表观扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)和3个特征向量(λ1、λ2、λ3)图。使用Paravision version 5.1软件，在每只大鼠的FA图上手动追踪胼胝体，左右视束作为感兴趣区(region of interesting, ROI)，然后，将感兴趣区移位到轴向扩散系数(axial diffusion coefficient, AD)和径向扩散系数(radial diffusivity coefficient, RD)图上的相同位置，记录各项指标。通过将主特征向量和FA图组合成RGB图像，生成FA伪彩图。

1.7 LFB髓鞘染色法

造模后48 d各组大鼠取3只进行灌注取材，脑组织行冠状位冰冻切片，切片厚度为30 μm。每只大鼠取胼胝体部位脑片3张，每组3只，贴于预先用明胶处理过的载玻片上。待自然晾干后，切片经蒸馏水清洗，入0.1%(质量分数)坚牢蓝(luxol fast blue, LFB)溶液，于室温密封浸染24 h。脑片经蒸馏水清洗后，95%(质量分数)乙醇-0.05%(质量分数)碳酸锂水溶液-70%(体积分数)乙醇分色，直至显微镜下观察灰质和白质部位区分清晰，背景无色为止。用苏木精-伊红复染5 min。用30%-50%-70%-90%-100%(体积分数)乙醇梯度脱水，每次10 min，髓鞘呈鲜蓝色，核呈深蓝色，二甲苯透明，中性树胶封片。正置显微镜下观察并拍照，对各组LFB染色情况进行评价，评分标准：0级：正常；1级：神经纤维结构紊乱；2级：明显空泡形成；3级：有髓神经纤维消失。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 EF对2VO模型大鼠学习记忆能力的影响

组间大鼠物体分辨指数比较,差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示，与sham组相比，model组的分辨指数显著下降(P<0.05)，与model组相比，EF各剂量及阳性药组分辨指数均显著升高(P<0.05,图1)。

图1 EF对2VO模型大鼠物体识别实验物体分辨指数的影响Fig.1 Effects of EF on discrimination index in new object recognition test of 2VO rats #P<0.05 vs sham group;*P<0.05，**P<0.01 vs model group. EF:epimedium flavonoids; 2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

2.2 EF对2VO模型大鼠胼胝体部位DTI参数变化的影响

各组大鼠间胼胝体部位FA、RD值差异有统计学意义(P<0.05)，ADC、AD值差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。两两比较显示，与假手术组相比，与模型组相比，EF高剂量(200 mg/kg)组大鼠胼胝体部位FA值明显升高(P<0.05)，RD值显著降低(P<0.05)。EF给药6周能够减轻脑缺血致胼胝体部位白质纤维束损伤。

图2 EF给药对2VO模型大鼠胼胝体部位DTI参数的影响Fig.2 Effects of EF on white matter fiber bundles in corpus callosum of 2VO rats detected by MRI-DTIA: color-coded FA images in the corpus callosum section at bregma 0.26 mm, B: quantitative analysis of FA； C: quanlitative ADC; D: analysis of AD; E: analysis of RD in the corpus callosum. n=6. #P<0.05, ##P<0.01 vs sham group; *P<0.05 vs model group; EF：epimedium flavonoids; MRI: magnetic resonance imaging; DTI: diffusion tensor imaging; FA: fractional anisotropy; ADC: apparent diffusion coefficient; AD: axial diffusion coefficient; RD: radial diffusivity; 2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

2.3 EF对2VO模型大鼠视束部位DTI参数变化的影响

各组大鼠间视束部位FA、 ADC、AD、RD值差异均有统计学意义(P<0.05)。两两比较显示，EF给药与模型组相比，EF高剂量(200 mg/kg)治疗组大鼠视束部位FA值显著升高(P<0.01)，RD值显著降低(P<0.05)。EF低、高剂量(100、200 mg/kg)治疗组ADC、AD值明显降低(P<0.05，图3)。EF给药6周能够减轻脑缺血致视束部位白质纤维束损伤。

图3 EF给药对2VO模型大鼠视束部位DTI参数的影响Fig.3 Effects of EF on white matter fiber bundles in corpus callosum of 2VO rats detected by MRI-DTIA: color-coded FA images in the corpus callosum section at bregma -3.14 mm, B: quantitative analysis of FA； C: quanlitative ADC; D: analysis of AD; E: analysis of RD in the corpus callosum. n=6. #P<0.05 vs sham group；*P<0.05, **P<0.01 vs model group. EF：epimedium flavonoids; 2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; MRI: magnetic resonance imaging; DTI: diffusion tensor imaging; FA: fractional anisotropy; ADC: apparent diffusion coefficient; AD: axial diffusion coefficient; RD: radial diffusivity; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

2.4 EF对2VO模型大鼠胼胝体部位髓鞘变化的影响(LFB染色)

各组大鼠间胼胝体部位着色程度差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较显示，与假手术组相比，模型组大鼠胼胝体部位着色程度显著减低，髓鞘结构紊乱明显。与模型组相比，EF高剂量 (200 mg/kg) 给药组能够明显增加2VO大鼠胼胝体部位的着色程度，髓鞘紊乱减轻 (图4A)。通过对髓鞘紊乱分级进行统计分析，发现模型组大鼠髓鞘紊乱分级值明显增高 (P<0.01),给予EF高剂量能够显著降低模型大鼠的髓鞘紊乱分级值 (P<0.05，图4B)。

图4 EF给药对2VO模型大鼠胼胝体部位髓鞘变化的影响(LFB染色)Fig.4 Effects of EF on demyelination in the corpus callosum of 2VO rats (LFB staining)A: representative images of brain sections stained with LFB (scale bar=50 μm); B: quantitative analysis of grading score for LFB-stained sections. ##P<0.01 vs sham group, *P<0.05 vs model group. EF：epimedium flavonoids;2VO: permanent bilateral common carotid artery ligation; LFB: luxol fast blue; EF(L): epimedium flavonoids 100 mg/kg; EF(H): epimedium flavonoids 200 mg/kg; Nim: nimodipine.

3 讨论

本研究主要采用2VO模型模拟CSVD的慢性脑缺血低灌注病理状态，给药6周后采用新物体识别实验检测各组大鼠学习记忆功能的变化。新物体识别实验是利用啮齿类动物喜欢探索新物体的习性来判断动物是否能够辨别新旧物体的行为学方法，被广泛应用于与认知障碍有关疾病动物模型的评价中，包括CSVD、神经退行性疾病、脑损伤模型等多个方面[10-11]。对新物体的偏爱用“分辨指数”指标进行量化，分辨指数高，则空间识别记忆能力好。本研究中，与sham组相比，2VO模型大鼠的分辨指数显著下降，各给药组均能升高模型组大鼠的分辨指数，表明EF可改善2VO模型大鼠的空间工作记忆及物体识别认知能力。2VO术后24 h开始连续6周给予EF治疗，可明显改善慢性脑灌流不足引起的学习记忆障碍，提示EF有可能改善CSVD患者的临床症状。

脑白质损伤是可在脑内观察到的CSVD最常见、最早的组织损害，被认为在CSVD损伤中起关键作用[5]。脑白质纤维在连接各脑区功能中起着非常重要的作用，各脑区之间功能连接异常可导致学习工作记忆障碍的发生[12]。DTI是MRI的一种特殊形式，能够对活体脑内的白质纤维结构进行非侵入性检测。常用的DTI参数包括： FA、ADC、AD、RD，这些指标被用来评估缺血后脑白质和灰质的神经元坏死、轴突断开和髓鞘降解情况[13-14]。其中，FA代表白质纤维完整性，并用于确定轴突的密度、分布和方向一致性，是检测脑损伤后白质纤维完整性最敏感的DTI参数之一[15]，其变化反映了脑白质微观结构完整性的改变。目前在许多动物模型中都发现FA减少，例如新生大鼠缺氧、缺血[16]，以及双环己酮草酰二腙小鼠模型[17]等。ADC与神经元丢失和白质髓鞘脱失有关[18]。AD代表轴突损伤，其与轴突肿胀和神经丝功能障碍有关[19]。RD代表脱髓鞘情况，多项研究[20-21]表明RD增加是髓鞘损伤的特异性标志。AD和RD分别表征特定于轴突和髓鞘的白质变化，增加的AD反映轴突的结构破坏，而增强的RD与缺血后广泛的髓鞘降解有关[22]。

本研究应用MRI-DTI检测各组大鼠脑白质胼胝体及视束部位FA、ADC、AD和RD值的变化，以评估EF对2VO模型大鼠脑白质纤维束的影响。结果提示EF可提高2VO大鼠术后6周的FA值，降低ADC值、AD值和RD值，提示EF可减轻脑白质的微结构损伤, 有较强的保护神经纤维完整性作用。同时采用坚牢蓝(luxol fast blue, LFB)染色对各组大鼠进行组织学评估，以验证DTI检测结果。LFB属于铜-酞菁染料，在乙醇溶液中具有与髓鞘磷脂结合的染色特性。应用LFB髓鞘染色可以很好地显示出神经组织的髓鞘结构。同样，本研究在LFB染色中也观察到2VO模型组大鼠胼胝体部位神经纤维结构紊乱，髓鞘排列疏松，有部分松解，且有明显空泡形成。EF给药可明显减轻髓鞘结构紊乱，减轻白质损伤。

综上所述，EF能够改善2VO模型大鼠胼胝体和视束部位髓鞘和轴突微观结构的损伤，减轻髓鞘的脱失及紊乱，改善慢性脑缺血低灌注引起的脑白质脱髓鞘病变，进而改善CSVD认知功能障碍。