紫色象草辐射诱变M2代的遗传和表型变异研究

朱 杰，武炳超，张 欢，洪文锴，邹 坤，李远丽，李佳璇，黄琳凯

（四川农业大学草业科技学院，成都 611130）

狼尾草属（Pennisetum Rich）是禾本科（Poaceae）黍亚科（Panicoideae A.Br.）的一年生或多年生草本植物，在全世界种类居多，约140种，大多数原产于非洲[1]，具有生长迅速、生物量大、利用价值高及耐瘠、耐肥、适应性强等特点[2]。其育种，包括品种资源的生产表现及优良新种质的创新受到国内外学者的普遍重视[3]，除了作为优良牧草外还可用作能源植物。在我国利用人工栽培的品种主要有多年生的象草（Pennisetum purpureum）、一年生的美洲狼尾草（Pennisetum americanum），及通过二者杂交产生的杂交种种杂交狼尾草（Pennisetum americanum×Pennisetum purpureum）等[4]。

象草，别名紫狼尾草，是禾本科狼尾草属多年生大型草本植物[5]。在20世纪40年代初，由我国的四川、广东从印度、缅甸先引入试种，之后传入湖南、江苏等地[6]，是一种适合在我国南方热带亚热带地区种植的优质饲草[7]。象草作为应用最为广泛的狼尾草属牧草之一，具有生长快、产量高、分蘖多、再生性强和适口性好等特点[8]，同时它的植物组织结构具有粗糙、坚硬、多茎和多孔的物理特性[9]，通常调制成干草或作为青刈饲料、青贮饲料喂养家畜[10]。20世纪90年代，美国研究中发现，象草能作为能源植物，进行乙醇、沼气和电能的生产[11-14]，可代替煤炭和石油等传统能源燃料，不会增加二氧化碳排放量，并能在一定程度上防止全球变暖。还有人将象草作为一种保护生态和美化环境的植物，其具有强大的根系，能深入土层，耐旱力较强，是净化空气、保持水土，调节气候的理想草种[15-16]。

SSR（simple sequence repeats，简单重复序列）分子标记是一类广泛分布于真核生物基因组中的小型重复片段，又叫微卫星分子标记，按照来源可以分为 gSSR（genomic SSR）和 EST-SSR（expressed sequence tag SSR）[17]。二者之间，gSSR分子标记具有更好的多态性[18]，因此其在遗传多样性和遗传完整性的检测中被广泛应用。本团队前期利用60Co-γ射线对象草种茎进行照射处理后出现了矮化的突变体植株，将矮化植株茎秆分割为包含两个茎节的小段再次种植，多年筛选后得到了保持矮化的突变体2代（M2）植株。然后对M2代矮化突变体的表型性状变异进行鉴定研究，并利用SSR分子标记技术对M2代突变体发生矮化的分子机制进行分析。初步探究了辐射诱变诱导象草矮化的遗传效应，并获得了两株明显矮化的象草突变体，为将来的象草育种项目提供原始材料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料共有24份，包括1份未经辐射的对照材料和23份M2代矮化突变体材料，种植条件相同，均栽培于四川农业大学成都崇州实验基地。利用60Co-γ射线照射象草发现了有明显的矮化突变体为M0代植株，随后将矮化植株茎秆分为包含两个茎节的小段再次种植，长大后仍保持矮化的植株为M1代，然后再进行一次选择后出现的矮化突变体为M2代。取幼嫩的叶片，清洗干净后利用冻存管保存在液氮中用于后续试验。材料均来自中国热带农业科学院牧草种质基因库，为了保证材料的遗传背景相同，所有的试验材料均利用无性繁殖的方式获得。

1.2 试验内容及方法

1.2.1 形态指标的测定

对植株进行正常的养护，在植株生长发育成熟后，就表型性状进行细致的观察记录。利用游标卡尺和米尺等工具，对24份供试材料进行包括分蘖数、株高（每株最高点的自然高度）、茎节数（最高分蘖的茎节数）、节间长（最高分蘖的节间长）、叶宽（叶片的最宽处）及茎粗共6个表型形态指标的测定。除了茎间长、茎节数及分蘖数有固定的数据外，茎粗重复测定10次，其余剩下的指标进行5次重复测定。

1.2.2 SSR分子标记

①DNA提取：在测定形态指标的24个单株中，取约1 g适量新鲜幼嫩的叶片，使用DNA快速提取试剂盒（天根生物科技有限公司，北京）提取DNA[19-20]，对于DNA的质量，并分别用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，将检测结果合格的样品保存于-20℃。在进行后续操作时，直接用TE将样品原液浓度稀释至20 ng/μL，并于4℃环境保存。

②SSR标记引物及反应体系：利用1个对照材料和随机挑选5个突变体作为引物的筛选，试验引物由本课题组前期对象草Survey测序获得的基因组数据开发[21]，从中选出gSSR和EST-SSR各20对引物用于筛选，并将扩增后条带清晰且多态性好的10对引物用于后续试验。PCR反应体系和程序及产物检测参照武炳超等[22]的方法。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 23.0统计分析软件对24个单株的形态指标数据进行处理，选择单因素方差分析（one-way ANOVA），对显著性水平进行方差同质性检验。对获得的清晰可重复的DNA条带进行统计，建立原始矩阵，在相同迁移位置上，对稳定且清晰的条带的有无赋值为“1”和“0”，并计算出多态性条带所占的比率（percentage of poly-morphic bands，PPB，Eq.1）。通过对 Popgene version 1.32[23]的使用，计算出供试材料的有效等位基因数（Ne，Eq.2）、Nei’s基因多样性指数（H，Eq.3）[24]以及 Shannon 信息指数（I，Eq.4）[25]，使用 NTSYSpc 2.1（Ver-sion 2.10s）统计分析软件计算对照材料与突变体材料之间的遗传相似系数（genetic similarity coefficient，GSC），并用Past 3绘制出供试材料之间的UPGMA聚类图，旨在探究矮化突变体材料与对照材料之间的亲缘关系。遗传多样性参数方程如下：

N为多态性条带的数量，M为条带总数，k为等位基因数，Pi为第i个等位基因的频率。

2 结果与分析

2.1 未经辐射的象草与诱变后M2代材料的表型差异

对24株象草材料分别进行形态指标的测量统计，突变体命名规则见表1。与对照相比，23株突变体植株中，除M2-11外其它植株均至少有一项形态指标存在显著或极显著差异（表1）。其中，有16株的株高、17株的叶宽以及10株的茎粗存在着显著或极显著差异，它们分别占总数的69.60%、73.90%和43.50%。并且，多数突变体植株的株高、茎节数和分蘖数，都出现了不同程度差异上的降低或减少，可能会降低相应突变体的生物量，产生了比较明显的变异。对数据进一步的分析，发现突变材料M2-8和M2-17的株高、叶宽和茎粗共3项指标，都与对照材料存在显著或极显著差异，分蘖数、节间长和茎节数都少于或低于对照材料，出现了明显的矮化。

表1 24份材料不同形态指标变异Table 1 Variation of morphological indexes of 24 materials

2.2 SSR标记差异

2.2.1 遗传多样性分析

对筛选出的10对引物进行电泳检测，扩增片段的大小为50～500 bp（图1），共扩增出了209条明显清晰可见的条带，其中多态性条带有201条，平均每对SSR引物扩增出的多态性条带为20.90条，引物的多态性条带的比率为96.17%，可见其多态性很高。多态信息含量（PIC）中引物EST3的PIC最大，引物 SSR14的 PIC最小（表 2），在 0.04～0.38之间，平均为0.25。对24份材料的基因多样性、Shannon信息指数、多态性信息含量（PIC）进行分析（表3），发现Shannon信息指数最大值为0.69，最小值为0.00，24份材料中遗传变异程度的差异很大，也说明经过辐射诱变后的象草突变体后代有丰富的遗传多样性。

表2 10对引物序列及其扩增结果Table 2 10 pairs of primer sequences and their amplification results

表3 24份材料基于SSR标记的多态性分析Table 3 Polymorphism analysis of 24 materials based on SSR markers

图1 引物SSR15扩增产物电泳图Figure 1 The electrophoresis of SSR15 amplification product

2.2.2 遗传相似性分析

将SSR引物扩增出的条带作为依据，计算出突变材料与对照材料之间的遗传相似系数。由表4可知，遗传相似系数在0.61～0.78之间，算出平均值为0.71，遗传相似系数不是很大。和对照相比，在所有的突变体材料中，与突变材料M2-1的遗传相似系数最小，为0.61，说明该材料与对照材料的遗传差异最大，亲缘性最不明显；而与突变材料M2-14的遗传相似系数最大，为0.78，说明其与对照材料的遗传差异最小，亲缘性最为接近。

表4 辐射M2代与对照材料间的遗传相似系数Table 4 Genetic similarity coefficient between radiation M2 generation and control material

2.2.3 UPGMA聚类分析

为进一步探究辐射M2代材料与对照材料之间的亲缘关系，通过非加权平均法（UPGMA），利用分析所得的条带原始矩阵对亲缘关系系统树（图2）进行构建。由图可见，突变材料M2-8和M2-17聚为一类，且它们与对照材料的遗传距离相差较远，说明这两株突变体材料发生变异的程度较大。图中显示，M2-1与对照材料之间的遗传距离最远，表明M2-1发生变异的程度是最大的。而M2-14和M2-15与M2-18和M2-19两个材料之间差异特别小，与对照材料的遗传距离也较近，说明它们变异的程度较小，发生变异的可能性较低。但对于其他突变体材料，都在不同距离不同程度与对照材料分开，表明它们都发生了不同程度的变异。

图2 M2代突变体材料的UPGMA聚类图Figure 2 UPGMA cluster diagram of M2 generation mutants

3 讨论

对于草食动物而言，象草可以为其提供大量优质牧草[26]。在植物景观方面，象草本身还具有一定的观赏效果[27]。矮秆小麦和水稻的应用是“第一次绿色革命”成功的关键因素之一，在前人的研究中发现，矮化性状与作物产量增加、高结实率、早熟和高分蘖能力之间存在密切关系。如毕波[28]利用100 Gy60Co-γ射线对沟叶结缕草愈伤组织进行照射，筛选其田间表型后进行了一年半的表型观察研究，发现了一株矮化突变体植株，经半年的修剪移栽，矮化突变体植株依然保持良好的性状，其叶片变短变宽、茎间直径变粗，草丛高度明显变矮，具有一定的遗传稳定性。武炳超等[29]利用10、20和30 Gy剂量的60Co-γ射线照射象草种茎，研究其表型性状变异时发现了两个显著矮小化的突变体F30-39和F30-41。刘天增等[30]将海滨雀稗4个品种Sea Isle 2000、Platinum、Supreme、Salam作为材料，利用60Co-γ射线以0.12 Gy/min 的强度在 0、40、45、50 和 55 Gy 5 个剂量下分别照射种茎，从辐射群体中共选育出叶宽、叶长、株高、匍匐茎节间长度和直径以及密度等9个指标均不同程度地优于各自对照的突变体材料，为新品种选育提供了优异的育种新材料。本试验前期利用60Co-γ射线对象草种茎进行照射处理后出现了矮化的突变体植株，将矮化植株茎秆分为包含两个茎节的小段再次种植，发现长大后紫色象草仍保持矮化，研究其表型性状与对照相比，23株突变体植株中除M2-11外均至少有一个或多个形态指标显著或极显著减小，具有一定的遗传稳定性。其中株高、分蘖数以及茎节数最为敏感，容易发生突变。经分析发现，多数突变体的株高、茎节数和分蘖数呈不同程度的降低或减少，可能造成大部分突变体生物量降低，发生矮化突变。矮化材料可以作为育种材料，与生物量比较高的材料进行杂交，得到抗逆性和生物量兼具的优质种质。对矮化突变体的发现，不仅可以丰富育种资源，甚至能够推动产业的发展，例如“绿色革命”的推动就是由于矮化品种应用到了育种之中。并且，矮化植株对于密集种植很适合，栽培和管理起来较容易，因而它在生产应用上相比于其他植株具有较大优势[31]。进一步分析，发现M2-8和M2-17的株高、叶宽和茎粗3项指标都与对照材料存在显著或极显著差异[32]，分蘖数、节间长和茎节数都少于或低于对照材料，出现了明显的矮化。

SSR标记是一种共显性分子标记，具有含量丰富、信息量高和多态性好的优点，被认为是最好的研究群体遗传变异的分子标记之一。例如杨延兵等[33]利用SSR标记对来源于不同生态区的12个骨干谷子品种进行遗传差异分析，发现12份材料的遗传距离变幅为0.14～0.80，平均为0.47。苗华荣等[34]利用SSR标记，以60Co-γ射线辐照花生品种鲁花11号，通过调查其M2代植株农艺性状，筛选得到了7个叶部特征明显变异的突变材料，并且发现突变材料与原品种之间，存在着不同程度的多态性，且都呈现出多个位点突变。于立伟等[35]利用SSR分子标记，对2个玉米（Zea mays）突变体和野生型进行遗传变异分析，证明遗传差异存在的真实性，本试验研究与其结果大体一致。总体来讲，本实验的结果仅仅对象草辐射M2代与对照材料之间，在分子水平上的遗传差异进行了鉴定，探究出了矮化突变体的突变原因，很大可能性是由遗传因素所引起的变异，对于可能发生突变的基因的鉴定还有待进一步深入研究。

4 结论

辐射后经两代筛选得到的矮化突变体象草都发生了不同程度的变异，其中株高、分蘖数和茎节数最为敏感，容易发生突变。结合所有供试材料表型及遗传变异的结果，推测矮化突变体的突变原因很大可能性是由遗传因素所引起的变异。同时，发现了两个显著矮小化的突变体材料M2-8和M2-17，可为后续象草遗传育种项目提供原始材料。