三七丹参片对高血脂小鼠血脂水平的影响

吴志焕，曹晓涵，曹丹丹

（1.河北工程技术学院，石家庄 050091；2.四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625014；3.河北医科大学公卫学院/河北省环境与人群健康重点实验室，石家庄 050017）

高脂血症是指脂代谢方面的多种问题[1]，包括胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白的升高等。研究降血脂药物首先要有高脂血症的动物模型，目前此类模型的动物主要有鼠类、兔、猪等动物，鼠类是最常用的动物模型。昆明小鼠作为基础实验的常用动物，具有操作简便，饲养方便，尤其具有生长发育较快，代谢旺盛等优点。因此，为了更好地研究群体对脂类代谢的特点，本文拟用昆明小鼠，通过高脂饲料的喂养[2]，建立小鼠的高血脂模型；用该高脂模型小鼠作为实验动物，研究降血脂药物三七丹参片对小鼠血脂水平的影响，以期为三七丹参片的进一步应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

昆明小鼠80只（雌雄各半，体重20 g左右），购于河北医科大学动物中心，购买后常规饲养一周，期间自由饮水，监测健康状况。按照下述方法分组和处理。

建立高脂模型组小鼠：选取20只昆明小鼠（雌雄各半），随机分为 2组（n=10），记为正常组和高脂组，并对各组小鼠称重记录。

三七丹参片降脂组小鼠：选取60只昆明小鼠（雌雄各半）。随机分为6组（n=10），记为空白对照组，高脂模型组，阳性对照组（辛伐他汀组），三七丹参片低、中、高剂量组，并对各组小鼠称重记录。

1.2 药品和试剂

辛伐他汀片及三七丹参片：购于常规药店，研钵内研磨成粉状备用。

血糖（GLU）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）检测试剂盒均购于Beckman Coulter，Inc.公司，糖化血清蛋白（GSP）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所有限公司。其他检测试剂均为分析纯。

饲料购于北京科澳协力饲料有限公司。配方：基础饲料为23.07%蛋白质+11.85%脂肪+65.08%碳水化合物；高脂饲料为基础饲料+15%猪油+20%蔗糖+1.2%胆固醇+0.2%胆酸钠。

1.3 仪器设备

超净工作台，全自动高压蒸汽灭菌锅，超速冷冻高速离心机，全自动生化分析仪，移液器等。

1.4 高脂模型小鼠建立

20只昆明小鼠，适应性饲喂1周，随机分为正常组和高脂组（n=10）。正常组饲喂基础饲料，高脂组饲喂高脂饲料，均为4～6 g/d只，自由饮水。连续饲喂30 d。每5天称重并记录体重。

1.5 降脂组小鼠处理

阳性对照组小鼠体灌胃0.01 g/（kg·d）辛伐他汀，低、中、高剂量组分别灌喂0.5、1.0、2.0 g/（kg·d）三七丹参片，高脂模型组和空白对照组以相同方法灌胃等体积生理盐水。连续灌胃30 d，每天称重1次，末次灌喂前16 h停食停水，末次灌喂1 h后即眼眶静脉采血。后颈椎脱臼法处死小鼠，取肝组织，称重记录后分为两份，1份甲醛固定，1份冻存于液氮，备用。

1.6 体重测定

动物适应性饲喂一周后称取各鼠体重。试验期间每5日饲喂前进行称重。试验结束前一天禁食禁水 12 h 以上称取体重。根据 0、5、10、15、20、25、30 d的体重，统计各组小鼠体重的增重情况，计算增重率，增重率=（终末平均体重-初始平均体重）/初始平均体重×100%。

1.7 血清处理及血脂指标测定

各组采血后血样室温放置 1 h后4℃冰箱过夜，3 000 r/min离心15 min，分离上层血清，-20℃保存，测各项指标。

按试剂盒说明书测定 TC、TG、LDL-C、HDL-C、GLU和GSP等6项指标。

1.8 组织采集和HE染色

各组小鼠脱颈处死后，迅速分离肝组织，称重，计算肝脏系数，肝脏系数=肝脏重/体重×100%。采集部分肝组织经4%多聚甲醛组织固定液进行固定。固定组织经HE染色分析其病理。

1.9 数据处理

所有数据经SPSS20.0软件处理。数据使用“平均值±标准差”表示。数据结果使用单因素方差分析，组间差异使用LSD法比较。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重

从 0、5、10、15、20、25 和 30 d 统计的体重数据分析，从第5天开始高脂组的体重就明显高于正常组，增长速度明显快于正常组，30 d试验结束时，高脂组小鼠体重比正常组平均重约3 g，其增重率高于正常组约12%。从第5天开始两组体重的增重率已经有显著差异（P20.01）。试验结果见表1。

表1 昆明小鼠体重增重结果统计（±S，n=10）Table 1 Weight changes of Kunming mice(±S，n=10)g

2.2 肝重及肝脏组织观察结果

试验结束取肝组织称重发现，正常组的肝重为（1.11±0.08）g，高脂组的肝重为（1.38±0.11）g，极显著高于正常组（P20.01）。肉眼观察肝脏组织，高脂组的肝脏体积明显增大，颜色泛黄，呈现出明显的脂肪肝病变（图1）；肝组织切片HE染色显微观察发现：正常组肝小叶结构清晰，肝细胞整齐排列，未见明显形态学变化；高脂组肝脏组织的结构明显病变，肝小叶结构消失，肝细胞内具有大小不等的圆形空泡（脂肪滴）。中央静脉和小叶间静脉还出现了少量红细胞（图2）。

图1 肝脏外观图Figure 1 Liver appearance

图2 HE染色肝组织图（1 600×1 200）Figure 2 Liver tissue stained with HE（1 600×1 200）

2.3 小鼠血脂水平的化学检测

通过生化分析测得高脂组血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）分别为正常组的 1.7倍、1.4倍、1.5倍，差异极显著（P20.01），但高密度脂蛋白（HDL-C）浓度高脂组与正常组无显著差异（P30.05）（表 2）。

表2 昆明小鼠血清血脂相关指标（±S，n=10）Table 2 Indexes of serum lipids in Kunming mice（±S，n=10）mmol·L-1

以上试验结果表明，高血脂小鼠模型建造成功，可用于后续试验。

2.4 三七丹参片对小鼠体重的影响

对正常小鼠和高脂小鼠进行不同种类和剂量的药品灌胃后，称量体重，结果如图3所示。根据结果可以看出，每组小鼠均有一定的体重增长，正常组、高脂组、阳性组以及三七丹参片高、中、低剂量组增重分别为 6.11、9.45、6.38、7.08、7.6 和 8.64 g。其中增重最低的是正常组，增重最多的是高脂组，符合试验预期。而服用了三七丹参片后，各组小鼠体重增加有所减少，其中高剂量组增重的减少最明显，最靠近阳性对照（即辛伐他汀片）。说明三七丹参片有良好的控制体重的效果。

2.5 三七丹参片对小鼠肝脏重的影响

对正常小鼠和高脂小鼠进行不同种类和剂量的药品灌胃后，处死后称量肝脏重和体重，计算肝脏系数，结果如图4所示。根据结果可以看出，服用了三七丹参片后，肝脏系数均有所降低，虽然差异不显著（P30.05），但其中高剂量组有明显的降低趋势。说明三七丹参片有良好的控制肝重的效果。

图4 三七丹参片对小鼠肝脏系数的影响Figure 4 Effect of Sanqi Danshen Tablet on liver coefficient of Kunming mice

2.6 三七丹参片对小鼠血液指标的影响

2.6.1 三七丹参片对小鼠血脂的影响

对正常小鼠和高脂小鼠进行不同种类和剂量的药品灌胃后，断颈处死立即采血，分离血清，按照试剂盒说明检测血清中血脂相关指标。结果如图5a～图5d所示。根据结果可以看出，服用了三七丹参片后，高剂量组的血脂指标有所降低，说明三七丹参片起到了良好的降血脂的效果。

图5 三七丹参片对小鼠血清血脂的影响Figure 5 Effect of Sanqi Danshen Tablet on serum lipid in mice

2.6.2 三七丹参片对小鼠血糖的影响

对正常小鼠和高脂小鼠进行不同种类和剂量的药品灌胃后，断颈处死立即采血，分离血清，按照试剂盒说明检测血清中血糖和糖化血清蛋白2项指标。结果如图6所示。根据结果可以看出，服用了三七丹参片后，高剂量组的2项血糖相关指标有降低，说明三七丹参片起到了良好的降血糖的效果。

图6 三七丹参片对小鼠血清血糖的影响Figure 6 Effect of Sanqi Danshen Tablet on serum glucose in mice

3 讨论

建立良好的高血脂模型对高脂血症以及降血脂药物的研究具有重要的意义。目前，常用的有基因缺陷型模型动物、注射或者高脂饲料饲喂等方法，以大鼠、小鼠和兔等动物为研究对象来建立高脂模型。基因缺陷型方法造价较高，注射方法动物较难长时间耐受，所以本研究选择操作简单的高脂饲料饲喂方法，并选取代谢水平较高、生长发育较快、易操作的昆明小鼠作为研究对象。

研究结果分析表明20只昆明小鼠均能很好地耐受高脂饮食，试验过程并没有拒食现象的出现。从饲喂第5天开始，高脂组与正常组体重就出现明显差异，其体重增长速度明显快于正常组，说明小鼠对高脂饲料的代谢与吸收具有良好的效果。30 d试验结束时，高脂组小鼠体重比正常组重约4 g，其增重率高于正常组约12%，这也符合高脂血症体重增加的特点，且经分析均具有统计学意义（P20.01）。试验结束称得肝重，结果显示高脂组的肝重明显高于正常组（P20.01），且肉眼观察发现，高脂组的肝脏体积明显增大，颜色泛黄，预示脂肪肝病变的出现，同时表明已初步成功建立了小鼠高脂模型。肝组织切片HE染色显微观察显示高脂组肝脏组织的肝小叶结构消失，肝细胞内具有大小不等的脂肪滴出现，中央静脉和小叶间静脉还出现了少量红细胞，充分表明高脂组肝脏组织结构明显病变，进一步验证高脂饲料喂养成功建立了高脂模型[3-4]。小鼠血清血脂的检测结果表明高脂组血清TC、TG和LDL-C等血脂指标均明显高于正常组（P20.01），说明本研究形成了预期的高血脂模型。

综上研究结果表明，通过给昆明小鼠饲喂30 d高脂饲料，成功建立了小鼠高脂模型，该模型与人类高脂血症症状极为相似，可为后续高脂血症临床药理的研究提供很好的实验模型[5]。

肝脏是脂质代谢的重要器官。研究证明，随着高脂饮食的喂养，小鼠的体重及肝重均会呈现高于正常组的趋势。观察三七丹参片干预是否可以改善高脂饮食带来的体重及肝重的增加。另外，以辛伐他汀为阳性对照，进行效果比对[6]。给药结束后，考察各组小鼠血脂（总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇）和血糖（糖化血清蛋白、葡萄糖）等指标[7-9]，观察三七丹参片干预对高脂小鼠血脂、血糖[9-10]的影响。本研究结果显示，三七丹参片对高脂食物造成的高血脂小鼠有很好的降血脂和降血糖作用。近年来，中草药综合调节血脂、血糖的优势，已成为降脂药物研究的主要方向[5]。三七丹参片除了增强免疫功能等疗效外[11]，本研究结果也为它在治疗高脂血症的应用提供了数据支持。