多浪羊POMC基因克隆及其在初情期不同组织中的表达研究

李庆瑾，隋志远，张继虎，张志帅，高庆华，邢 凤

（塔里木大学动物科学学院/新疆生产建设塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300）

阿片黑素促皮质激素原（proopiom elanocortin，POMC）是位于下丘脑弓状核（ARC）的前皮质醇，是动物脑和垂体中多种活性肽类和激素的共同前体，如促肾上腺皮质激素[1-2]。POMC神经元是位于下丘脑内的重要组成部分，分泌的多肽如β-内啡肽在哺乳动物繁殖活动中发挥重要调节作用。鸡POMC基因首先被克隆，人POMC基因在2号染色体2p23位点上，包含3个外显子，含有2个CpG岛[3]。家兔POMC在2号染色体上，编码区由249个氨基酸组成[4]。POMC表达由垂体和下丘脑中不同且独立的转录增强子控制，牛POMC基因在11号染色体上，长度为7 479 bp，有 3 个外显子[5]。

动物POMC基因在下丘脑、脑垂体、脑干、皮肤、淋巴系统等组织中含量较高。Liu K.等[6]研究发现POMC在鸡的下丘脑、垂体等表达，在垂体中表达量最高，该基因的多态性与鸡的繁殖性状相关。马淑慧等[7]还证实POMC基因表达量与绵羊毛色的生成有一定的相关性。周梅等[8]研究发现在小尾寒羊和苏尼特羊垂体中POMC基因表达最高，其次是下丘脑，在其他组织中均微量表达。杜富宽等[9]对刀鲚的POMC基因进行了克隆及表达分析，其cDNA序列长度为1 212 bp，具有699 bp的开放阅读框，编码232个氨基酸，POMC在健康刀鲚的脑高表达，在鳃、肾、精巢相对高表达，在肝、脾、肠、头肾、肌肉和卵巢中微表达。

在初情期时，机体通过抑制或兴奋下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）神经元脉冲式释放GnRH启动初情期；Kisspeptin是GnRH释放的一个强有力的刺激因子[10]，POMC系统可以通过一个包含ARCKisspeptin神经元的网络间接地刺激GnRH神经元以启动初情期[11]。在初情期启动的过程中，鸭下丘脑POMC的表达发生了显著变化，POMC表达的下调对初情期启动起协同作用[12]。

研究表明POMC与动物的初情期具有一定的关联性[12]，但POMC基因与绵羊初情期启动关联性的研究还较少。母羊初情期是指母羊首次发情并排卵的年龄，是母羊获得繁殖能力的标志[13]，母羊初情期越早，就越早能进行配种，繁殖性能越高[14]。多浪羊是新疆羊肉优良风味的典型代表，是新疆典型的早熟品种，4～5月龄达到初情期，6～8月龄可初配[15]。因此，本项目以多浪羊为研究对象，对其POMC基因cDNA进行克隆，利用Real-time PCR（qPCR）技术分析下丘脑、垂体和卵巢中POMC基因在初情期时的表达情况，为进一步揭示POMC基因在多浪羊初情期启动中的作用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及样品采集

1.1.1 实验动物及发情鉴定

实验动物：30只未发情多浪羊母羊，年龄、体重相近，选自新疆五征绿色农业发展有限公司。母羊90日龄后开始进行初情期外观察看，早晚各放入公羊试情1～2 h。评定母羊发情的标准为母羊以下表现：兴奋不安、对外界刺激非常敏感、频排尿、外阴红肿有黏液、静立接受公羊爬跨。

1.1.2 样品采集

对于达到初情期发情期的5只母羊进行屠宰，迅速采集初情期的多浪羊大脑、下丘脑、垂体、卵巢、子宫、输卵管、脾、肺和肾等9种组织，立即将新鲜的组织放入5 mL冻存管中，并置于液氮中保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成

将上述采集的组织样品取50～100 mg加入液氮研磨，采用Trizol-酚-氯仿一步法提取上述采集组织的总RNA，此步骤全程在冰上进行，然后对总RNA浓度和质量进行检测，-80℃保存备用。

利用天根试剂盒对提取的RNA进行反转录以合成 cDNA，反转录体系为 25 μL，包括总 RNA 2 μL，oligo（dT）18（0.25 μg/μL）2 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2 μL 和 RNase free H2O 7 μL，然后 65 ℃ 5 min，冰浴 2 min。再加入 5×First strand Buffer 4 μL，DTT（0.1 mmol/μL）1 μL，RNase inhibitor（40 U/μL）1 μL，Supperscript TM Ⅲ反转录酶（200 U/μL）0.6 μL，RNase free H2O 5.4 μL。

1.2.2 引物合成及PCR扩增

参考NCBI上公开的绵羊POMC基因mRNA序列（NP_001009266.1）设计引物，见表1，提取卵巢组织总RNA，反转录成cDNA，然后对多浪羊POMC基因的cDNA序列进行扩增。PCR反应体系为:Premix 12.5 μL，10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μL，cDNA 1 μL，9.5 μL ddH2O。PCR 反应程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 20 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，36个循环；72℃延伸5 min。利用1.2%的琼脂凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小和完整性。将扩增出来的产物回收、克隆测序，测序由上海生物工程技术服务有限公司完成，最后对序列进行比对及分析。

1.2.3 多浪羊POMC基因表达分析

根据前期测序得到的多浪羊POMC基因cDNA序列跨设计引物（表1），用qPCR试剂盒检测POMC基因在下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫中的表达水平，以ACTB基因作为内参基因。qPCR反应体系：2×SG Green qPCR Mix 7.5 μL，10 μmol/L 的上下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 5.5 μL；qPCR 反应程序:95℃预变性10 min，95℃变性20 s，退火60℃30 s，40个循环，然后72℃延伸5 min。每个样品重复检测3次，定量完成后得到不同样本的Ct值，利用2-ΔΔCt法计算POMC基因相对表达量，最终的结果用IBM SPSS Statistics 26软件进行单因素方差分析显著性比较，P20.05（差异显著）、P20.01（差异极显著）为判断标准。

表1 基因克隆及定量PCR引物Table 1 Primers used for POMC gene cloning and qPCR

1.2.4 多浪羊POMC同源性比较及发育树构建

利用DNAMAN软件将测序结果进行拼接后，用BLAST程序将克隆得到的序列与NCBI公布的绵羊POMC基因参考序列进行同源性检索。利用SignalP5.0在线分析软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对POMC氨基酸序列进行潜在信号肽预测。采用MEGA5.0软件对POMC基因氨基酸序列基于遗传距离的邻接法（NJ）构建遗传距离进化树。

2 结果与分析

2.1 多浪羊POMC基因cDNA克隆

以多浪羊卵巢组织总RNA为模板，通过RT-PCR扩增、克隆测序获得两条POMC cDNA序列（图1），分别长1 078、1 108 bp，两条序列的CDS完全一样，大小为792 bp，该CDS编码263个氨基酸，与第一个相比，第二个5'UTR有一个143 bp的插入。

图1 多浪羊卵巢POMC基因PCR扩增结果Figure 1 The result of POMC PCR products in Duolang sheep

2.2 POMC序列同源性与系统发育分析

从NCBI中获得绵羊、牛和山羊等6个物种的POMC氨基酸序列，利用DNAMAN软件将多浪羊POMC氨基酸序列（图2）与这6个物种的序列进行同源性比较（图3），比对结果发现多浪羊POMC氨基酸序列与绵羊和其他物种的序列表现出相当高的同源性，与绵羊（NP_001009266.1）、牛（NP_776576.1）、山羊（XP_017911043.1）的同源性分别为99.62%、96.6%、96.3%；与猪（AAB32312.1）、马（XP_014586753.2）、人（AG46625.1）的同源性分别为89.51%、83.08%以及79.78%。

图2 多浪羊POMC基因编码区及氨基酸序列Figure 2 Duolang sheep POMC gene CDS and deduced amino sequences

图3 不同物种间POMC氨基酸序列比较Figure 3 Comparison of POMC amino acid sequences among different species

利用SignalP 5.0软件对多浪羊POMC氨基酸进行信号肽预测，结果表明多浪羊POMC蛋白1～26氨基酸为其信号肽部分。利用MEGA5.0软件制作了系统发育树（图4），显示多浪羊POMC氨基酸与绵羊、山羊、牛的亲缘关系极近，与人、猪、马的亲缘关系较远。

图4 系统进化树分析Figure 4 Phylogenetic rooted tree analysis

2.3 多浪羊POMC基因组织表达谱分析

利用半定量RT-PCR检测了多浪羊POMC基因在大脑、下丘脑、垂体、卵巢、子宫、输卵管、脾、肺和肾9种组织中的相对表达量，结果显示（图5），POMC基因在检测的组织中均表达，其中在垂体和下丘脑中的表达量相对较高，其他组织中的表达量相对较弱。

图5 POMC基因9种组织表达谱Figure 5 POMC gene expression profiles in nine tissues

2.4 多浪羊POMC基因在初情期时不同组织中mRNA表达水平分析

为了研究多浪羊POMC基因mRNA在初情期不同组织的中的表达规律，进一步对达到初情期的多浪羊5个相关生殖组织即卵巢、下丘脑、垂体、输卵管和子宫的表达情况进行了real-time PCR检测。结果如图6所示，垂体中POMC基因的表达量显著高于其他组织（P20.05），下丘脑中POMC基因表达量显著高于卵巢、输卵管及子宫（P20.05），该基因在生殖轴相关的下丘脑、垂体中高表达，推测其可能参与调节下丘脑-垂体-性腺轴，并且对多浪羊初情期发挥着重要调节作用。

图6 POMC基因在5种组织中的表达量Figure 6 POMC gene relative mRNA levels in the five tissues

3 讨论

3.1 哺乳动物POMC基因序列分析

哺乳动物POMC基因在结构和序列上均表现高度保守性，在哺乳动物的下丘脑、垂体中高表达，在睾丸间质细胞、卵巢细胞及免疫系统的细胞中也有表达，对于动物生殖和代谢等功能具有十分重要的作用[2-3]。

POMC基因cDNA序列在多种哺乳动物中已被克隆出来[16]，本研究对多浪羊POMC基因进行克隆及序列分析，多浪羊POMC基因有两个转录本，第一条长1 078 bp，第二条长1 108 bp。这两个转录本的不同是在5′UTR，可变剪接可以形成不同的转录本，它在真核生物中普遍存在[17]，本试验POMC由于可变剪接也可能形成了两种不同的转录本。将多浪羊POMC氨基酸序列与其他物种进行同源性比较，发现其与绵羊、牛、山羊的同源性均在96%以上，与猪、马、的同源性在83%以上，与人的同源性为79.78%，说明多浪羊POMC氨基酸序列与牛、山羊、马等哺乳动物的同源性均较高，该基因在物种进化过程中高度保守，功能稳定。

3.2 POMC基因表达与绵羊初情期等繁殖性能关系

POMC基因在中枢神经系统和外周组织中广泛分布[18]。周梅等[8]检测发现POMC基因在小尾寒羊和苏尼特羊垂体中表达量最高，而大脑、小脑、卵巢输卵管和子宫中表达量比较低。本研究结果发现，POMC在多浪羊垂体中的表达量是最高的，其次是下丘脑，在卵巢、输卵管、子宫、肾、肺、脾和大脑中的表达水平很低。本研究结果与周梅等研究结果一致[8]，而下丘脑、垂体对绵羊发情相关激素GnRH、FSH、LH的分泌有调节作用，梁慧慧等[19]研究发现在哈萨克羊下丘脑POMC基因表达可以通过直接或间接的途径参与GnRH的分泌与合成，可能是参与调节哈萨克羊发情相关通路的重要基因。综上所述，我们推测POMC基因也可能参与多浪羊下丘脑-垂体-性腺轴的调节，对多浪羊初情期的启动发挥一定的作用。

4 结论

本研究通过基因克隆获得多浪羊POMC基因两条cDNA序列，通过同源性比较与绵羊、牛、山羊、猪，马、人的同源性较高，说明该基因在进化过程中功能稳定。在多浪羊初情期中，POMC分别在下丘脑-垂体-性腺轴（HPG）的垂体中显著性表达，其次在下丘脑中也有高表达，表明POMC对多浪羊初情期的调控发挥一定的作用，这对于进一步探索POMC与绵羊初情期间的关系提供了科学的理论依据。