不同NFC/NDF饲粮对青海藏羊育成母羊肌肉抗氧化功能、肌纤维类型组成及其相关基因表达的影响

周 力，高占红，张春梅，马博妍，李蒋伟，桂林生，侯生珍

（青海大学农牧学院，西宁 810016）

藏羊作为青藏高原及其毗连地区特有的种质资源，肉质以其鲜美、营养全面、矿物质含量丰富以及膻味少等优点而深受消费者的青睐[1-2]。然而由于青海畜牧业受当地草地面积和生态环境的限制，藏羊的饲养方式由传统的放牧饲养逐步变为舍饲，而舍饲造成羊肉品质劣化已经引起了很多研究者的关注与重视。

不同肌纤维类型的比例是调控肌肉品质的关键因素[3]。肌纤维作为骨骼肌的基本组成单位，其数量主要是由先天遗传决定的，但肌纤维类型之间却可相互转化[4]。营养水平是连接肌纤维类型改变与肉品质的重要桥梁，部分学者已经对此进行报道[5]。以猪为研究对象[6]，发现品种和营养水平会对背最长肌糖原含量和肌纤维类型产生明显的影响。其他试验也证实[7]，适宜的蛋白水平饲粮，不仅可以使肌肉纤维的直径增大，同时还能增加肌间脂肪和肌肉间质含量，进而提高肌肉的产量和风味。目前，通过调整营养摄入量来改善畜禽肉质已经成为研究的热点，然而主要集中于鸡、鸭和鹅等家禽，对反刍动物的研究相对较少，关于饲粮组成与藏羊肌纤维形态特征更是鲜有报道。

鉴于此，本试验旨在以不同NFC/NDF饲粮条件下育成期藏羊背最长肌作为试验材料，利用ATP酶染色法、MyHCs基因的mRNA表达量对肌纤维进行分型以及ELISA法测定肌肉抗氧化能力，分析肌纤维类型组成的差异与抗氧化能力的大小。通过改变饲粮营养需要量来调控肌纤维类型的分布，从而改善肌肉品质，同时对于加强保护和利用藏羊特色品种资源具有重要的意义。

1 材料和方法

1.1 试验动物与分组

从青海省海北州高原现代畜牧示范园区选取体况良好、体重相近（26.65±0.72）kg的4月龄藏羊15只，随机分为3组，分别饲喂NFC/NDF水平为0.92（L组）、1.39（M组）和2.20（H组）的饲粮。试验分为预试期15 d和正试期90 d。

1.2 饲养管理与试验饲粮

试验开始前，动物严格按照养殖场管理规定进行驱虫、免疫等常规操作。试验期间每日07:30和18:00各饲喂1次，自由采食和自由饮水，饲料全部为精饲料和燕麦干草粉搅拌混合料。基础饲粮组成和营养水平见表1，饲粮设计参照参考《肉羊饲养标准》（NY/T 816-2004）[8]进行。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets(DMS)

1.3 试验方法

1.3.1 肌纤维组织学特性分析

在饲养试验结束时，分别从每组随机选取接近平均体重的3只试验羊按照颈静脉放血处死，立即取左侧胴体正数第12～13肋骨间背最长肌组织2份，其中1份用于迅速放入液氮中用于抗氧化指标以及MyHCs基因表达量的测定，另外1份置于4%多聚甲醛溶液（广州赛国生物科技有限公司）固定24 h，利用ATP酶组织化学对藏羊背最长肌进行染色[9]，利用Olympus BX51显微镜以及Imaginge pro plus 6.0在20×10倍下观察并分析肌纤维特性，每个样本取3张非连续切片，每张切片选4个完整的视野，使研究的肌纤维数目不少于1 500根[10]。测出肌纤维横截面上最长两点间距离，作为长轴，再过长轴中点量出垂直于长轴的长度作为短轴，求出两者的几何平均值作为肌纤维直径[11]。同时直接测量记录肌纤维的横截面面积，作为肌纤维横截面积，测多根求其平均值[12]。

测出每个视野的面积，计算出每个视野肌纤维的根数，换算成每平方毫米的根数，作为被测样本的肌纤维密度[13]。统计每种类型肌纤维的数量，用每种类型肌纤维数量除以总肌纤维数量记为该种肌纤维的数量比例[14]。再用每种类型肌纤维总面积除以总肌纤维面积记为该种肌纤维的面积比例[15]。

1.3.2 肌肉抗氧化指标测定

测定羔羊肌肉中抗氧化指标，分别为过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，丙二醛（malondialdehyde，MDA）以及总抗氧化能力（total antioxygentic capacity，TAOC）含量。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，操作步骤见试剂盒说明书。

1.3.3 肌肉MyHCs基因表达量测定

使用北京天根生化科技有限公司动物组织总RNA提取试剂盒提取藏羊背最长肌中总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，经微孔板分光光度计测定其吸光度（OD）值，样品OD 260/280在1.8～2.2之间用于后续试验。cDNA合成按Fast KingRTKit cDNA反转录试剂盒说明操作，反转录后的cDNA于-20℃保存备用。采用罗氏Light Cyler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪测定MyHC Ⅰ、MyHC Ⅱa、MyHC Ⅱb和MyHC Ⅱx基因相对表达量。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参基因，目的基因的mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。内参及引物设计均由上海生工合成，序列见表2。

表2 引物序列及参数Table 2 Sequences and parameters of primers

1.4 数据处统计分析

所有试验数据经Excel 2020软件初步处理后，采用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准误（mean±SE）”表示，P20.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同NFC/NDF饲粮对藏母羊肌纤维组织形态学特性的影响

由表3可知，M组Ⅰ型肌纤维直径低于H组（P20.05）和L组（P30.05）。M组Ⅰ型肌纤维横截面积低于L组（P20.05）与H组（P30.05）。M组肌Ⅱa型、Ⅱb型纤维横截面积与其他2组差异不显著（P30.05）。M组Ⅰ型肌纤维密度高于H组（P20.05）和L组（P3 0.05）。M组Ⅱa型肌纤维密度显著高于L组（P20.05），较H组差异不显著（P30.05）。

表3 不同NFC/NDF饲粮对藏母羊肌纤维发育特点的影响Table 3 Effects of different NFC/NDF diets on muscle fiber development characteristics of Tibetan ewes

由表4可知，M组Ⅰ型肌纤维数量比例显著高于L组（P20.05），较H组差异不显著（P30.05）。L组Ⅱa型肌纤维数量比例显著高于H组（P20.05），较M组差异不显著（P30.05）。M组Ⅱb型肌纤维数量比例显著低于L组（P20.05），较H组差异不显著（P30.05）。

表4 不同NFC/NDF饲粮对藏羊肌纤维数量比例的影响Table 4 Effects of different NFC/NDF diets on the proportion of muscle fiber quantity of Tibetan sheep %

由表5可知，L组Ⅰ型肌纤维面积显著低于其他2组（P30.05）。M组Ⅱa型肌纤维面积比例显著高于其他2组（P20.05）。M组Ⅱb型肌纤维面积比例显著低于L组（P20.05），较H组差异不显著（P30.05）。

表5 不同NFC/NDF饲粮对藏羊肌纤维面积比例的影响Table 5 Effects of different NFC/NDF diets on proportion of muscle fiber area in Tibetan sheep %

2.2 不同NFC/NDF饲粮对藏母羊MyHCs基因表达量的影响

由图1可知，M组MyHC Ⅰ基因的mRNA相对表达量显著高于L组（P20.05），较H组差异不显著（P30.05）。L组MyHC Ⅱa基因的mRNA相对表达量显著高于H组（P20.05）；较M组差异不显著（P30.05）。L组MyHC Ⅱb基因和MyHC Ⅱx基因的mRNA相对表达量显著高于M组（P20.05），较H组差异不显著（P30.05）。

图1 藏羊肌纤维类型相关基因的mRNA相对表达量Figure 1 Relative mRNA expression levels of muscle fiber type related genes of Tibetan sheep

2.3 不同NFC/NDF饲粮对藏母羊肌肉抗氧化功能的影响

由表6可知，L组过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性显著低于M组（P20.05），较H组差异不显著（P30.05）。M组谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性高于 L组（P30.05）和 H组（P20.05）。各组间总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量差异不显著（P30.05）。

表6 不同NFC/NDF饲粮对藏母羊肌肉抗氧化能力的影响Table 6 Effects of different NFC/NDF diets on antioxidant capacity of muscle of Tibetan ewes

3 讨论

3.1 不同NFC/NDF饲粮对藏母羊肌纤维组织形态学特性的影响

动物出生后，肌肉中肌纤维的数量已基本确定，但一些外界因素如营养水平、环境温度、运动状态和应激等均会影响肌纤维类型之间的相互转化[16-17]。根据肌纤维所含肌球蛋白重链的不同，可将其分为4种类型，即Ⅰ型（慢速氧化型肌纤维）、Ⅱa型（快速氧化型肌纤维）、Ⅱb型（快速酵解型肌纤维）和Ⅱx型（中间型肌纤维）[18]。MyHCs基因表达量的高低，又可表现为肌纤维类型的转化。因此，研究不同骨骼肌肌纤维类型的组成及其MyHCs基因的表达水平对于改善羔羊肉质具有重要的实践意义。Hwang Y.H.等[19]指出，增加Ⅰ型纤维的比例和降低Ⅱb型纤维的比例能够提高肌肉嫩度，进而改善牛肉品质。G.Renand等[20]研究也发现，Ⅱb型肌纤维比例与剪切力呈正相关，但与嫩度呈负相关。白艳苹等[21]进一步证明，日粮添加乳酸菌可以通过提高氧化型肌纤维的比例改善肌肉色泽，提高肌肉嫩度，从而提高羊肉品质。以牦牛为研究对象[22]，发现氧化型纤维比例高可改善肉质，同时肌纤维类型与其肌球蛋白重链基因表达丰度具有一定的联系。以上研究均表明酵解型纤维比例过高会造成肉质降低，这与本试验肌纤维类型研究结果具有相似之处。本试验通过ATP酶染色法和MyHCs基因表达量对肌纤维分型，得出适宜NFC/NDF饲粮能使青海藏羊背最长肌肌纤维类型由酵解型纤维（MyHC Ⅱb和MyHC Ⅱx）向氧化型纤维（MyHC Ⅰ和MyHC Ⅱa）转化。由此说明适宜的NFC/NDF饲粮可以增加氧化型纤维的数量，从而改善羔羊肉质。

3.2 不同NFC/NDF饲粮对藏母羊背最长肌抗氧化功能的影响

正常情况下，机体内自由基的生成与其机体抗氧化防御系统之间处于一种动态平衡，一旦受到自身或外在因素影响后，体内的平衡会被打破，从而造成氧化损伤[23]。机体主要抗氧化物质包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，总抗氧化能力和丙二醛含量等。其中过氧化氢酶主要参与活性氧代谢过程[24]。丙二醛能够间接地反映机体内氧自由基代谢的状况[25]，谷胱甘肽过氧化物酶能够促进过氧化氢、有机氢过氧化物和脂质氢过氧化物的还原，保护机体免受氧化损伤[26]，超氧化物歧化酶主要作用是清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤[27]，而总抗氧化能力是衡量机体抗氧化系统功能的综合指标[28]。据报道，宰后肌肉的氧化反应能够明显地影响食用品质，但在动物饲粮中适当加入抗氧化物质、选择合适的饲养方式以及适当的加工保存等均可影响宰后肌肉的氧化速率，继而提高肌肉品质[29]。有试验表明，在母羊饲粮中适宜降低精料比例有利于产后早期断奶羔羊提高抗氧化能力[30]。本试验中，与L组和H组相比，M组肌肉总抗氧化能力含量升高，同时超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性提高，而丙二醛含量则下降。这表明适宜的NFC/NDF饲粮能够降低氧自由基的影响，提高机体抗氧化能力，从而达到改善肉质目的。

4 结论

综上，在本试验条件下，适宜的NFC/NDF饲粮可使育成期藏母羊背最长肌氧化型肌纤维类型的数量增多并有效提高抗氧化能力，其中NFC/NDF为1.39的饲粮效果较好。