遮阴对野扇花生理指标及代谢产物积累的影响

敬洪霞,张俊波,薛 建,杜红梅

(1上海交通大学设计学院,上海 200240;2上海交通大学农业与生物学院,上海 200240)

野扇花(Sarcococca ruscifolia)是黄杨科清香桂属常绿灌木,主要分布于我国贵州等西南省份,目前多处于野生状态。野扇花不仅能够生长在路旁等光照充足的条件下,也能生长在林下等高度荫蔽的条件下[1-3],而且具有浓郁的花香,是一种非常有发展前景的园林植物。

耐阴性是植物在低光环境下的生存和生长能力[4]。植物的光补偿点(Light compensation point,LCP)越低,耐阴性越强[5]。荫蔽条件下,耐阴植物叶片膨大,比叶面积增加,导致更多的辐射被截留,同时叶绿素a∕b(Chlorophyll a∕b,Chl a∕b)的比例下调,光合效率提高[6]。而在强光条件下,耐阴植物的叶绿体结构、叶绿素含量和光合速率等会发生相应的变化[7-9],从而影响植物的生长和发育。研究表明,与我国华东地区常见的耐阴植物八角金盘(Fatsia japonica)、一叶兰(Aspidistra elatior)、狭叶十大功劳(Mahonia fortunei)和洒金桃叶珊瑚(Aucuba japchica)相比,野扇花的光补偿点最低,具有极强的耐阴性[10]。

随着分析和检测技术的发展,代谢组学已经成为研究植物逆境胁迫的重要方法[11]。光照强度显著影响苹果(Malus domestica)果皮中糖类、有机酸、氨基酸和酚类物质的积累[12]。吴能表等[13]研究表明,随光照强度减弱,长春花(Catharanthus roseus)叶片中淀粉和可溶性糖含量下降,而可溶性蛋白、游离氨基酸和硝态氮含量升高。目前,关于代谢产物积累和植物耐阴性关系的研究,鲜有报导[12,14]。本研究通过分析夏季不同遮阴强度对野扇花相关生理指标以及代谢产物积累的影响,以探究影响野扇花生长的可能生理机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为经过2年栽培管理的野扇花扦插苗,由上海迪士尼苗圃提供。2018年3月中旬,挑选生长发育良好,且苗高、株型、长势基本一致的盆苗60株(盆径22 cm,高20 cm,株高35—40 cm),移至上海交通大学农业工程训练中心温室内。45 d后,移入遮阴棚内。遮阴棚长宽高均为2 m,棚间距为1 m。棚内日温26—38℃,夜温24—30℃,相对湿度60%—80%。

1.2 试验设计

试验采用单因素随机区组设计,设置CK(全光照,遮光率0%)、T1(遮光率约50%)和T2(遮光率约90%)3个处理,正午时,其光合有效辐射分别为1 000—1 200μmol·m-2·s-1、500—600μmol·m-2·s-1和100—150μmol·m-2·s-1。每个处理重复5次,每个重复至少1盆,30 d后取枝条中上部的成熟叶片,进行相关指标分析。

1.3 指标测定

1.3.1 叶片生理指标

取CK、T1、T2各组新鲜的叶片1 g左右,清洗干净后用吸水纸吸去多余的水分,去除叶脉后称重,测定不同处理的干物质含量(Dry matter content,DMC)。取CK、T1、T2各组新鲜的叶片4—5片,去除叶柄后剪成长10 mm,宽3—4 mm的小段,称取0.1 g左右,采用二甲基亚砜法提取叶片中叶绿素,根据Arnon[15]的方法计算叶片中叶绿素总量、叶绿素a(Chlorophyll a,Chl a)、叶素素b(Chlorophyll b,Chl b)和类胡萝卜素的含量(mg∕g·DW)。采用Blum等[16]和Bradford[17]的方法,分别测定不同处理叶片的电解质外渗(Electrophyte leakage,EL)和可溶性蛋白含量。

1.3.2 代谢产物提取、衍生化和气相色谱-质谱分析

取-80℃保存的野扇花叶片,液氮充分研磨后,参考Rizhsky等[18]和Du等[19]的方法进行代谢产物的提取、甲氧基化和硅烷化,并使用美国安捷伦公司7890A-5975C型气相色谱-质谱(Gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)联用仪进行分析。以核糖醇为内标,以代谢产物与核糖醇面积的比值作为代谢产物的相对含量。

1.4 数据统计与分析

应用SPSS Statistic 22软件,采用最小显著差数法进行统计分析(P<0.05)。采用SigmaPlot 10.0和SIMCA 13.0软件绘制图表。根据代谢产物的相对表达量采用SIMCA-P 11.0软件,对代谢产物进行偏最小二乘法判别分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),计算不同代谢产物的变异权重系数(Variable importance of projection,VIP),并绘制热图。

2 结果与分析

2.1 遮阴对野扇花相关生理指标的影响

由表1可知,随着遮光度的增加,野扇花叶片中叶绿素总量、类胡萝卜素含量、Chl a、Chl b含量以及Chl a∕b的比值都呈现显著上升的趋势,且不同遮阴处理组的含量存在显著差异,与植株外部的形态一致(图1)。遮阴显著降低了叶片的干物质含量和细胞的电解质外渗(P<0.05),不同遮阴处理组间差异不显著。另外,遮阴使叶片中可溶性蛋白的含量增加,与对照相比,T2条件下,叶片中可溶性蛋白的含量显著增加。

表1 遮阴对野扇花叶片相关生理指标的影响Table 1 Effects of shade treatments on related physiological indexes of leaves in Sarcococca ruscifolia

图1 不同遮阴处理对野扇花生长的影响Fig.1 The effects of different shading treatment on the growth of Sarcococca ruscifolia

2.2 遮阴对野扇花叶片相关代谢产物积累的影响

2.2.1 遮阴对野扇花叶片中代谢产物种类和含量的影响

采用GC-MS方法在野扇花叶片中检测到600多个化合物峰(图2)。利用美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology,NIST)2011数据库检索后,鉴定得到100种代谢产物,包括24种有机酸、22种氨基酸、28种糖、12种糖醇、9种胺类化合物和5种其他化合物。其中糖类的含量和数量最多(表2)。

表2 不同光照处理对野扇花叶片中代谢产物积累的影响Table 2 Effects of light intensity treatments on the accumulation of metabolites in leaves of Sarcococca ruscifolia

图2 野扇花叶片代表性的气相色谱-质谱总离子流色谱图Fig.2 Representative total ion current chromatogram map of gas chromatography-mass spectrometry from leaves of Sarcococca ruscifolia

(续表2)

PLS-DA结果表明,GC-MS处理结果具有较好的重复性,不同遮阴处理显著影响代谢产物的积累。其中第一主成分的贡献率是36.6%,可以将全光照处理和两个遮阴处理区别开,第二主成分的贡献率是21.0%,可以将中度遮阴和重度遮阴的代谢产物区分开来(图3)。

图3 野扇花叶片代谢产物偏最小二乘法判别分析Fig.3 Partial least squares discriminant analysis chart of metabolites in leaves of Sarcococca ruscifolia

与对照相比,夏季高温条件下遮阴90%,野扇花叶片中氨基酸和糖类的总量显著增加,分别比对照增加21.90%和46.79%(图4)。

图4 不同光照条件下野扇花叶片中有机酸、氨基酸、糖和糖醇的总相对含量Fig.4 Total relative contents of organic acid,amino acid,sugar and sugar alcohol of Sarcococca ruscifolia under different light conditions

与CK相比,在T1和T2条件下,分别有8种、2种(阿魏酸和延胡索酸)和14种,以及11种、3种(阿魏酸、延胡索酸和核糖酸)和10种有机酸含量无显著变化、显著增加和显著下降。同样,在T1和T2条件下,分别有16种、1种(丙氨酸)和5种,以及12种、5种和5种氨基酸含量未发生显著变化、显著增加和显著下降(表2)。

糖是野扇花叶片中含量最丰富的代谢产物,在T1条件下,有10种、6种和13种糖的含量未发生显著变化、显著增加和显著下降;在T2条件下,8种糖的含量未发生显著变化,7种糖(包括阿拉伯呋喃糖、呋喃核糖、果糖、半乳糖、景天庚酮糖、熊果苷和呋喃果糖)的含量显著增加,尤其是果糖和半乳糖含量的增加可能对T2条件下糖总量的增加发挥重要作用;另外,有13种糖含量显著下降(表2)。

在T1和T2条件下,均有4种糖醇的含量没有显著变化,1种糖醇的含量显著增加,7种糖醇的含量显著下降。在T1和T2条件下,分别有8种、0种和1种胺(乙醇胺),以及4种、2种和3种胺的含量未发生显著变化、显著增加和显著下降。在T1和T2条件下,磷酸(T1)和硼酸(T2)显著增加,其他4种代谢产物的含量均未发生显著变化(表2)。

2.2.2 遮阴条件下野扇花标志性代谢产物筛选

对代谢产物进行平均归一化处理后,根据Pearson相关系数对代谢物进行聚类,获得VIP前50位的代谢产物热图(图5)。总体变化趋势和PLS-DA分析结果(图3)一致,遮阴后代谢产物积累发生显著变化。景天庚酮糖等17个代谢产物的积累,可能和野扇花耐阴性极强有关。在这17个代谢产物中,变异权重系数大于1,与对照相比,差异显著(P<0.05),且代谢产物含量变化超过1.5倍的,总共有9个,分别是延胡索酸、阿魏酸、丙氨酸、苏氨酸、景天庚酮糖、半乳糖、呋喃核糖、果糖和尿嘧啶,这9种代谢产物可以作为野扇花耐阴候选标记物。在T1条件下,仅有景天庚酮糖和半乳糖的含量变化大于1.5。而在T2条件下,所有9种代谢产物的含量变化均大于1.5。说明,重度遮阴对代谢产物积累的影响更大。与对照相比,在两种遮阴条件下含量变化最大的是景天庚酮糖(表3)。

表3 影响野扇花耐阴性的标志性代谢产物Table 3 Signature metabolites that influence shade tolerance of Sarcococca ruscifolia

图5 不同光照条件下野扇花叶片代谢产物聚类后的热图Fig.5 Heat map with clustering of different metabolites in leaves of Sarcococca ruscifolia under different light conditions

3 讨论

植物所处的光环境影响植物的光合作用。在不遮光条件下,野扇花叶片出现明显的黄化现象,可能是强光条件下叶绿体的结构遭到破坏所致[9]。在荫蔽增强的情况下,耐阴植物叶片中叶绿素总量显著增加,有利于植株在弱光条件下更好的吸收、传递和转化光能。Chl a∕b的比值表示在弱光条件下植物对光能的利用效率。遮阴条件下,野扇花Chl a和Chl b含量以及Chl a∕b的比例增加,表明野扇花植株在遮阴条件下,吸收红光和蓝紫光的能力增强,有利于光能的传递。遮阴条件下,野扇花叶片干物质含量的下降可能与弱光下叶片的光合作用下降有关。与遮阴相比,全光照下野扇花叶片的EL值显著上升,这可能是遮阴降低了叶片的日灼所致。可溶性蛋白是反应植物生理功能的重要指标,在重度遮阴下野扇花叶片中可溶性蛋白含量增加可能和野扇花耐阴性极强有关。

本研究选择出9个和野扇花耐阴性相关的代谢产物,这些化合物可能参与能量代谢、细胞骨架的形成以及渗透调节等。现有的研究表明,景天庚酮糖的积累可能和胞间CO2浓度增加有关,在落地生根(Kalanchoëpinnata)[20]和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)[21]中均发现了由于CO2浓度增加导致的景天庚酮糖积累。Huang等[22]在对华北蹄盖蕨(Athyrium pachyphlebium)的研究中发现,随着光量子通量密度下降,胞内CO2浓度(Intercellular CO2concentration,Ci)增加。在野扇花中,也发现了Ci的类似变化(结果未显示)。景天庚酮糖是7-磷酸景天庚酮糖的代谢产物,在碳固定的途径中发挥着重要作用[21],而关于景天庚酮糖含量变化和植物耐阴性的关系,还有待进一步分析。延胡索酸是三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle,TCA)的中间产物,细胞内环境的变化影响延胡索酸的积累。Biais等[23]发现,低氧的环境有利于甜瓜(Cucumis melo)果实中延胡索酸的积累。Bekele等[24]也发现,低氧和高CO2环境有利于延胡索酸的积累。

在干旱条件下,在拟南芥(Arabidopsis thaliana)[18]、马铃薯(Solanum tuberosum)[25]、杂交狗牙根(C ynodon dactylon×C.transvaalensis)[26]和抗冷的水稻(Oryza sativa)[27]中发现了半乳糖的积累。在长期高温条件下,在杂交狗牙根叶片中也发现了半乳糖的积累[19]。半乳糖的积累可能和其他渗透调节物质的合成有关[27],而关于半乳糖的积累和植物耐阴性的关系,未见报道。苏氨酸是一种芳香族氨基酸,可能也参与渗透调节[28-29]。在重度遮阴条件下,野扇花叶片中果糖的含量显著增加。Li等[12]研究发现,在苹果发育前期,在荫蔽条件下果糖的含量显著高于光照条件下。果糖主要来自于蔗糖的分解。随着光照强度的下降,葡萄糖含量无显著变化,可能是因为蔗糖分解产生果糖和葡萄糖,而葡萄糖又分解释放能量所致。

阿魏酸是一种酚酸,是木质素合成的中间产物[30]。Li等[12]研究表明,光照条件没有显著影响苹果‘Jonamac’果皮中阿魏酸的含量。Ingersoll等[31]研究表明,与暗条件相比,在光下,山胡椒(Lindera benzoin)叶片中阿魏酸含量显著增加。Solecka等[32]研究表明,低温有利于冬油菜(Brassica napusvar.oleifera)叶片中阿魏酸的积累和苯丙氨酸解氨酶活性的增加,可减少细胞的过氧化伤害。而阿魏酸在野扇花耐阴方面的具体功能还有待进一步分析。相关研究表明,低氧胁迫条件下,如水淹,TCA循环的支路开启,启动了丙氨酸和γ-氨酸丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)活化,导致植物体中丙氨酸和GABA的富集。而在重度荫蔽条件下,丙氨酸和GABA富集的原因还有待进一步分析。

野扇花是一种耐阴性很强的植物,本研究表明,野扇花的耐阴性可能和荫蔽条件下光合色素的积累、叶片细胞膜完整性的增加以及重度荫蔽下可溶性蛋白的积累有关。通过对关键代谢产物分析发现,部分代谢产物的积累,尤其是景天庚酮糖和半乳糖,可能和野扇花的耐阴性有关。而关于是否是由于荫蔽导致野扇花叶片中CO2浓度增加,进而诱导相关代谢产物的积累,从而增加了野扇花的耐阴性,还有待进一步分析。