果园生混合干草对羔羊胃肠道细菌多样性的影响

李腾飞，刘崇义，靳旭妹，曹馨悦，陈新义，王莹莹，龙明秀

（西北农林科技大学草业与草原学院，陕西 杨凌 712100）

青干草作为反刍动物及其他草食动物重要的饲粮来源，直接影响动物的生长发育和畜产品质量[1]。近年来，随着人类对高品质畜产品的需求不断增加[2-3]，草地的可持续利用和优质饲草的供应逐渐成为养殖户面临的首要问题[4-5]，“果–草–畜”复合系统使林果业与养殖业有机结合，符合可持续发展与生态种养的总体要求，其生产的干草是反刍动物的优质饲草来源。

反刍动物胃肠道内细菌微生物通过降解宿主本身难以消化的纤维素、半纤维素和木质素等物质，为机体提供生长所需的能量和养分。日粮通过影响动物胃肠道微生物菌群组成和多样性进而对胃肠道生理指标的变化产生影响，如pH 等。据报道[6]，牦牛日粮由高纤维向高谷类转变时，瘤胃微生物代谢产生大量酸性物质，导致pH 下降，影响瘤胃微生物多样性和群落结构。Xue 等[7]研究指出在中国青藏高原地区不同饲养方式对耗牛瘤胃微生物具有显著影响。Henderson 等[8]通过分析全程饲喂不同日粮的32 种反刍动物的瘤胃菌群组成发现，优势菌群主要以普氏菌属(Prevotella)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)为主。综上所述，饲粮组成的多样化对动物胃肠道菌群结构和组成具有重要的影响。

在耕地有限和国家实行“双减一增”政策的大背景下，如何提高农区土地利用效率，发展高效安全的畜牧业成为当前研究的重要课题。研究发现，“果–草”复合系统能明显提高果实可溶性糖、可溶性固形物、维生素C 含量[9]、土壤酶活性和微生物数量[10]。但对于“果–草–畜”模式下草对反刍动物胃肠道细菌群落多样性影响的研究相对较少。本研究基于16S rDNA 测序技术平台，通过饲喂不同果园混合干草对萨能奶山羊公羔瘤胃和肠道菌群的组成、菌群多样性及优势菌群的变化进行分析，为渭北旱塬“果–草–畜”生态种养循环提供可靠的理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本试验在渭南市蒲城县海源种植家庭农场进行。选取健康的2月龄萨能奶山羊公羔(11.48 ±0.55 kg) 24 只，随机分为4 组(按体重相近的原则)，每个处理3 个重复，每个重复2 只公羔，试验期85 d(预饲期15 d、正试期70 d)。试验采取单栏饲养，其中，对照组羔羊饲喂当地养殖户配制的混合粗饲料[主要为玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、紫花苜蓿(Medicago sativa)以及少量田间杂草]，其他3 个组为试验组，分别饲喂燕麦草(Avena sativa) + 紫花苜蓿WL168HQ 混合干草(Ⅰ组)、多年生黑麦草(Lolium perenne) + 紫花苜蓿WL168HQ 混合干草(Ⅱ组)、毛苕子(Vicia villosa) + 多年生黑麦草(Ⅲ组)混合干草。

试验日粮配制依照《肉羊饲喂标准(NY/T 816–2004)[11]》进行配制。饲喂前将各组饲草切短(长度为3～5 cm)后按1 ꞉ 1 比例混合后组成混合干草。精料补充料为：玉米68%、麸皮3%、豆粕24%、小苏打1%、预混料4% (每千克预混料含维生素A 2 640 IU、维生素D 340 IU、铁60.00 mg、锌48.00 mg、锰48.00 mg、维生素E 26.00 mg、铜12 mg、钴0.12 mg、碘0.30 mg、硒0.36 mg)。精料饲喂量为羊只体重的0.8%。精饲料与粗饲料分开饲喂，保证料槽中有10%的剩料。4 组日粮精粗比一致，营养水平如表1所列。

表1 各组混合干草的营养水平(干物质基础)Table 1 Nutrient contents of mixed hay in each group (dry matter basis)

1.2 饲养管理

试验前，对试验羊舍进行清理和消毒，并对所有试验羊进行防疫和体内驱虫，试验期间所有试验羊均单栏饲喂。每日08:30 和16:30 饲喂，并确保第2日上午饲喂前，料槽内仍有10%左右剩料。试验期间，公羔自由采食、自由饮水，及时打扫羊舍，对羊圈定时消毒、通风。

1.3 瘤胃及肠道内容物的采集与处理

试验期结束后，每组选择3 只体重相近的试验羊进行屠宰，屠宰后立即采集瘤胃及盲肠内容物，并分别置于5 mL 的冻存管中，−80 ℃冰箱保存，用于瘤胃和肠道细菌微生物区系测定。

1.4 瘤胃微生物和肠道微生物的16s rDNA 测定

使用E.Z.N.A.®Stool DNA Kit 试剂盒提取细菌总DNA，琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 提取质量，紫外分光光度计对DNA定量。使用341F (5′-CCTACG GGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACHVG GGTATCTAATCC-3′) 引物扩增16S rDNA(V3+V4)可变区[12]。PCR 扩增程序和步骤与Li 等[13]研究论文一致，并由杭州联川生物技术股份有限公司完成。

1.5 数据处理

采用Excel 2010 对数据进行整理，SPSS 23.0 软件进行统计分析，结果以“平均数 ± 标准差(mean ±SD)”表示，在0.05 和0.01 水平上进行方差分析。用QIIME 2 程序分析α 多样性和β 多样性，用R 3.5.2软件包绘制图像。序列比对采用QIIME 2 插件特征分类器，比对数据库为SILVA 和NT-16s，以SILVA数据库注释结果为准，其他图由Origin 2018 进行绘制。

2 结果与分析

2.1 不同混合干草对肠道菌群多样性的影响

2.1.1 混合干草对肠道菌群Alpha 多样性的影响

通过Venn 图(图1) 呈现出各处理组共有和特有 的feature 数目，共检测到5491 个feature 数目。不同混合干草组(Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和CK 组)的feature 数目分别为1 380、2 068、857 和1 186。总体来看，Ⅰ组和Ⅱ组有着较高的feature 数目。

图1 混合干草盲肠微生物菌群的feature 数目Figure 1 Number of intestinal microbial flora of mixed hay

肠道细菌的多样性分别用Shannon 指数、Simpson指数和Chao1 指数来解释(表2)，Ⅱ组的Chao1 指数和Shannon 指数显著高于其他组(P< 0.05)。且各处理组的Simpson 指数显著高于对照组(P< 0.05)。各组中的覆盖度均接近于99%，说明对肠道微生物具有较高的覆盖度。综合结果表明，Ⅱ组和Ⅰ组中羊肠道微生物具有较高的Alpha 多样性。

表2 混合干草对盲肠菌群Alpha 多样性的影响Table 2 Effects of mixed hay on the Alpha diversity of intestinal flora

2.1.2 混合干草对山羊盲肠菌群Beta 多样性的影响

对不同样品基于UniFrac 的非加权主坐标分析(PCoA) (图2b)，第1 主坐标(PCoA1) 和第2 主坐标(PCoA2)的贡献率分别为26.35%和15.61%。4 种不同饲养模式下各肠道样品完全分离，无交叉现象，同组样品具有明显的聚集性。基于UniFrac 的非加权距离的UPGMA 聚类图(图2a)可以看出，各组样品聚类情况较好，每组可单独聚为一类，可以看出组内样品相似度高于组间，说明不同混合干草饲喂模式下山羊肠道微生物存在差异。

图2 混合干草对盲肠菌群Beta 多样性的影响Figure 2 Effects of mixed hay on the beta diversity of intestinal flora

2.1.3 混合干草对山羊肠道菌群组成影响分析

根据物种注释结果显示，萨能奶山羊公羔盲肠细菌一共检测到27 门(图3)，可以看出，厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinomycetes)、蓝藻菌门(Cyanophyta) 和拟杆菌门(Bacteroidetes)等是肠道微生物中相对丰度较高的细菌。Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组厚壁菌门的相对丰度显著高于CK 组(P< 0.05)，大小依次为Ⅰ组> Ⅱ组 >Ⅲ组 > CK 组；CK 组中，变形菌门的相对丰度显著高于其他3 组(P< 0.05)；Ⅱ组中拟杆菌门的相对丰度显著高于其他3 组(P< 0.05)。在属水平上(图3)，丰度较高的菌有罗姆布茨菌、劳森氏菌属、梭状芽胞杆菌、克里斯滕森菌属R7、瘤胃球菌属_NK4A214。Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组中罗姆布茨菌、梭状芽胞杆菌的相对丰度显著高于CK 组(P< 0.05)；而劳森氏菌属则显著低于CK 组(P< 0.05)。Ⅱ组和CK 组中克里斯滕森菌属R7 的相对丰度显著高于Ⅰ组和Ⅲ组(P< 0.05)。

图3 门、属水平的盲肠细菌群落组成Figure 3 Composition of the intestinal bacterial communities in goats at the phylum and genus levels

2.2 混合干草对瘤胃菌群多样性的影响

2.2.1 混合干草对瘤胃菌群Alpha 多样性的影响

通过Venn 图(图4) 呈现出各处理组共有和特有 的feature 数目，共检测到13 055 个feature 数目。不同混合干草(Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和CK 组)的feature数目分别为3 819、3 272、3 423 和2 541。总体来看，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组均有着较高的feature 数目，从而推断出使用果园优质混合干草饲喂山羊，使其瘤胃微生物具有较高的多样性。

图4 不同混合干草的瘤胃微生物菌群feature 数目Figure 4 Number of rumen microbial flora of different hay mixtures

Ⅰ组和Ⅲ组的Chao1 指数高于其他组，但不显著(P> 0.05)。且饲用果园混合干草各组的Shannon指数高于对照组，均没有达到显著差异(P>0.05)。4 组中的覆盖度指数均接近于99%，说明对瘤胃微生物具有较高的覆盖度。综合结果表明，Ⅲ组和Ⅰ组羊瘤胃微生物具有较高的Alpha 多样(表3)。

表3 混合干草对瘤胃菌群Alpha 多样性的影响Table 3 Effects of mixed hay on the Alpha diversity of rumen flora

2.2.2 混合干草对瘤胃菌群Beta 多样性的影响

对不同样品基于UniFrac 的非加权主坐标分析(PCoA) (图5b)，第1 主坐标(PCoA1) 和第2 主坐标(PCoA2)的贡献率为16.69%和13.66%。4 种不同混合干草饲喂下各瘤胃样品完全分离，无交叉现象，同组样品具有明显的聚集性。基于UniFrac 的非加权距离的UPGMA 聚类图(图5a)可以看出，每组样本的聚类性都很好，而且每组都可以被分为一个单独的组。综合结果表明，组内样本的相似度高于组间样本的相似度，不同混合干草饲喂下羔羊瘤胃微生物存在差异。

图5 混合干草对瘤胃菌群Beta 多样性的影响Figure 5 Effects of mixed hay on the rumen bacterial Beta diversity

2.2.3 不同混合干草对瘤胃菌群组成分析

根据物种注释结果(图6 )，萨能公羔瘤胃细菌共检测到21 门(phyla)，拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、螺旋体门(Spirochaetes)、变形菌门(Proteobacteria)是瘤胃微生物中相对丰度较高的细菌。Ⅲ组中拟杆菌门的相对丰度显著高于其他3 组(P< 0.05)，但厚壁菌门和纤维杆菌门的相对丰度却低于其他3 组，且与Ⅰ组和Ⅱ组呈显著性差异(P< 0.05)；螺旋体门则无显著性影响(P> 0.05)；Ⅱ组的变形菌门相对丰度显著高于其他3 组(P< 0.05)。在属水平上，普氏菌属(Prevotella)、理研菌科(Rikenella)RC9、纤维杆菌属(Cellulomonas) 和克里斯滕森菌属(Christensenella) R7 等属为瘤胃细菌群落中的优势菌属。其中，Ⅲ组普氏菌属的相对丰度显著高于其他组(P> 0.05)；Ⅱ和Ⅲ组中理研菌科RC9 的相对丰度显著高于CK 组(P> 0.05)，而纤维杆菌属则刚好相反；克里斯滕森菌属R7 各组间无显著差异。

图6 门、属水平的瘤胃细菌群落组成Figure 6 Composition of the goat rumen bacterial communities at the phylum and genus levels

3 讨论

3.1 混合干草对羔羊瘤胃和盲肠菌群多样性的影响

细菌群落的丰富度和均匀度等指标可以通过样品中的feature 数目和Alpha 多样性分析来表示。反刍动物瘤胃微生物多样性与日粮组成、健康状态及管理等因素密切相关，而饲粮组成是影响群落多样性及结构的重要因素[14-15]。日粮成分越复杂，瘤胃微生物多样性就越高[16]，粗蛋白更有利于瘤胃微生物的分解利用[17]。本研究瘤胃样本与CK 相比，Ⅰ组(3 819)、Ⅱ组(3 272)和Ⅲ组(3 423)均有着较高的feature 数目。肠道作为大量微生物存在的栖息地，形成了复杂独特的肠道微生态系统[18]，且作为宿主生命的有机组成部分，对其生长发育具有非常重要的影响[19]。本研究肠道样品中Ⅰ组(1 380) 和Ⅱ组(2 068)有着较高的feature数目，这与Zheng 等[20]在日粮中添加菊苣(Cichorium intybus)草料增加鸡肠道微生物群落多样性而有益于肠道健康研究结果一致。总体来看，使用紫花苜蓿 + 多年生黑麦草和紫花苜蓿 + 燕麦混合干草饲喂羔羊，使其胃肠道细菌微生物有着较高的多样性。基于Beta 多样性对瘤胃和盲肠菌群进行分析，结果发现每组均单独聚为一类，组内样品相似度高于组间，说明不同混合干草饲喂下羔羊瘤胃和盲肠细菌群落均存在差异。刘桂芹等[21]研究发现饲喂方式对驴盲肠细菌群落多样性，且各组单独聚为一类，与本研究结果相同。同样，不同料重比的猪基于Beta 多样性的肠道微生物结构存在显著差异[22]。

3.2 混合干草对羔羊瘤胃和盲肠菌群结构的影响

在肠道细菌群落中，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组厚壁菌门的相对丰度显著高于CK 组，其大小依次为Ⅰ组 >Ⅱ组 > Ⅲ组 > CK 组；Ⅱ组的拟杆菌门相对丰度显著高于其他3 组。大量研究结果表明，厚壁菌门和拟杆菌门是反刍动物肠道菌群中的优势菌群[23-24]，厚壁菌能促进肠道微生物分解纤维素，类杆菌是促进碳水化合物利用的优势菌群[25-26]。本研究中，饲用果园混合干草各组与对照组相比在厚壁菌门相对丰度占比中凸显出了绝对优势，其分别占Ⅰ组(92.77%)、Ⅱ组(87.74%)和Ⅲ组(76.98%)；而饲用紫花苜蓿 + 多年生黑麦草混合干草(Ⅱ组)，在拟杆菌门相对丰度中占有一定优势，其相对丰度达到了5.16%。与吴海丽[27]在不同季节圈养岩羊肠道微生物厚壁菌门72.73%、拟杆菌门16.61%的含量基本一致。变形菌门是中除包含纤维素降解菌、半纤维素降解菌、蛋白质降解菌等以外，还包含很多如大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌等致病菌，容易引起动物腹泻等疾病[28]。本研究中，对照组中的变形菌门相对丰度显著高于其他3 组，这表明饲用果园优质混合干草对平衡肠道菌群具有重要的作用。

在瘤胃细菌多样性中，萨能奶山羊公羔瘤胃细菌在门水平共检测到21 种，拟杆菌门(38.28%～54.93%)、厚壁菌门(32.65%～42.77%)、纤维杆菌门(2.20%～8.94%)、螺旋体门(2.97%～5.35%)、变形菌门(1.20%～2.91%)是瘤胃中高丰度的细菌。许多研究表明，类杆菌、厚壁菌和变形杆菌是反刍动物瘤胃中的3 种优势菌[29-30]。魏园等[31]对梅花鹿瘤胃微生物的研究发现，在饲喂柞树(Quercus mongolica)叶时，拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门的丰度在生物总量的90%以上，而本研究中各组的拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门的总丰度在79.91%～89.39%，二者结论相似，陈丽娟等[32]在对不同比例构树(Broussonetia papyrifera)与苜蓿混合对安格斯母牛瘤胃细菌多样性的影响研究中也证明，这3 种细菌丰度总量在80% 以上；Kim 等[33]利用16S rRNA 基因测序技术研究发现反刍动物瘤胃菌群中厚壁菌门(57.8%) 和拟杆菌门(26.7%) 在数量上占主导地位。进一步验证瘤胃微生物群落总体是以这3 种菌群为优势群落。从属水平来看，纤维杆菌属是纤维杆菌门下的唯一菌属[34]，本研究中，饲喂多年生黑麦草 + 毛苕子混合干草使纤维杆菌的丰度显著降低，不利于纤维杆菌的生长。普氏菌广泛参与多种微生物的代谢，具有高活性降解半纤维素和适应不同膳食结构的能力，在蛋白质、淀粉、木聚糖和果胶的降解中起着重要作用[35]。

多年生黑麦草 + 毛苕子组普氏菌属的相对丰度显著高于CK 组，说明饲喂多年生黑麦草 + 毛苕子混合干草能在一定程度上增加普氏菌的数量，进而提高半纤维素的分解效率。

此外，根据现有的细菌数据库，发现了大量未鉴定菌属，这可能是萨能奶山羊瘤胃内独特的微生物菌群，在今后的研究中有待于进一步发掘。

4 结论

本研究表明，不同混合干草饲喂萨能奶山羊公羔时，可以提高瘤胃及肠道细菌群落多样性，改善胃肠道微生物区系，通过增加胃肠道中有益细菌的丰度和减少致病菌的丰度来促进营养代谢，促进健康，其中以紫花苜蓿 + 多年生黑麦草混合干草效果最佳。