串联质谱技术在阳江市新生儿遗传代谢性疾病临床应用与研究

敖东，刘恩赐，吴莹莹，黄晓凌，陈凤喜

广东省阳江市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心，广东阳江 529500

遗传代谢性疾病（IMD）是由基因突变造成参与体内代谢的运转蛋白、酶及膜或受体缺陷，使机体发生代谢紊乱，引起代谢产物蓄积或终末代谢产物缺所致的疾病，种类复杂多样，危害严重，大部分会引起患儿严重智力障碍，甚至可能病死[1-3]。目前，IMD已成为新生儿疾病筛查中重要项目之一，早期IMD患儿临床表现缺乏典型性，诊断难度较大，易出现误诊，直接影响疾病的治疗。早期筛查、早期确诊、尽早实施对症治疗是确保新生儿健康成长的重要手段。细菌抑制法、酶联免疫法、荧光法、时间分辨荧光法等是临床筛查新生儿IMD的传统手段，但一次实验只能检测一种疾病，筛查效率较低[4-5]。串联质谱技术可筛查出氨基酸代谢异常、有机酸代谢异常和脂肪酸代谢异常等疾病，能够同时检测至少30种疾病标志物，逐渐被应用于新生儿IMD的筛查中[6-7]。该研究整群选择2019年7月—2020年12月期间在阳江市妇幼保健院和该市另外18家医院统一将标本送至阳江市新生儿疾病筛查中心接受IMD筛查的新生儿12 409例为研究对象，分析串联质谱技术在新生儿IMD临床应用效果，以期为临床提供参考依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

整群选择在阳江市妇幼保健院和该市另外18家医院统一将标本送至阳江市新生儿疾病筛查中心接受IMD筛查的新生儿12 409例为研究对象，出生日龄3～8 d，平均出生日龄（3.61±0.43）d；男7 080例，女5 329例；足月分娩11 846例，早产儿563例。该研究经医学伦理委员会审核批准。入组新生儿家长均对该研究知情，自愿签署知情同意书。

1.2 方法

①标本采集。所有新生儿均在出生后3 d后接受IMD筛查，且充分哺乳≥6次。按摩或热敷新生儿足跟，并用75%乙醇消毒皮肤后，待乙醇完全挥发后，使用一次性采血针刺足跟内或外侧，处深度＜3 mm，用干棉球拭去第1滴血，取第2滴血，将Whatman 903标准滤纸片接触血滴，使血自然渗透至滤纸背面形成血斑，确保滤纸上血斑直径＞0.8 mm，至少采集3个血斑。血片悬空平置，自然晾干呈深褐色，置入统一专用的标本采集塑料袋内，保存于2～8℃冰箱内，尽快送检。②串联质谱技术检测：使用美国SCIEX公司的SCIEX API 3200串联质谱分析仪测定血斑中的脂肪酸、氨基酸、有机酸等指标及其比值，首先用打孔器将空白滤纸片、高低质控制品和标本打出直径为3 mm的血斑，置入96孔聚丙烯板孔内，在孔内加入含有氨基酸、酰基肉碱同位素内标工作液，每孔100μL，封膜，45℃环境下，孵育震荡45 min，650～750 r/min，再提取75μL上清液，置入V型底检测板内，用铝膜覆盖，最用SCIEX API 3200系统检测。广州丰华公司提供实验过程所用质控品和试剂盒，实验严格按仪器、试剂操作说明书筛查。见表1、表2。

表1 各种氨基酸的参考值范围

表2 各种肉碱的参考值范围

1.3 可疑病例确诊试验

对串联质谱技术筛查初筛阳性者实施生化、血常规、血氨、血糖、血同型半胱氨酸、丙酮酸、尿有机酸和尿酮体检测，并实施基因分析和血气分析，作为进一确诊试验。

1.4 初筛阳性与基因确诊

12 409 例新生儿经串联质谱技术筛查初筛阳性IMD 352例（2.83%），按阳江市新生儿疾病筛查技术规范要求，对所有初筛阳性患儿召回重新采血复查一次和进行尿有机酸分析，对复查阳性和尿有机酸异常的患儿进行基因分析，最终确诊3例（0.02%）。①高苯丙氨酸血症（HPA）、基因结果：CDS12；Het错义突变。②原发性肉碱缺乏症（PCD）、基因结果：c.760C＞(p.R254X)。③3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症（MCCD）、基因结果：chr3 exon12 c.1 331 g＞A(p.r444h)杂合突变。

1.5 治疗与随访

对于确诊的3例IMD患儿分别为高苯丙氨酸血症（HPA）1例、原发性肉碱缺乏症（PCD）1例、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症(MCCD)1例。HPA确诊后立即给予低血苯丙氨酸（Phe）饮食，选择低Phe或无Phe的奶粉、面、米等，确保蛋白质、热量和一定数量Phe摄入，随着患儿年龄不断增长，对食谱及时调整，注意补充微量元素和维生素，定期监测血Phe浓度。PCD确诊后按照血液游离肉碱(C0)浓度给予左卡尼（国药准字H20000522）治疗，50～200 mg/（kg·d），分次服用，待C0水平恢复正常后维持剂量（终身服药），避免饥饿。MCCD确诊后立即给予生物素（国药准字H20031188）10～40 mg/d治疗，急性期辅助低蛋白质、肉碱摄入等治疗。跟踪随访1年，定期影像学检查、体格发育检查和心理发育检查等，并密切观察血液中氨基酸谱等浓度。

1.6观察指标

分析串联质谱技术在新生儿IMD中筛查价值。

1.7 统计方法

采用SPSS 21.0统计学软件分析数据，计数资料以频数及百分比表示，组间差异比较以χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

12 409 例新生儿经串联质谱技术筛查出高度疑似IMD 352例（2.83%），其中确诊3例（0.02%）。3例确诊IMD患儿均为足月分娩儿，其中HPA 1例、PCD 1例、MCCD 1例。随访1年，3例患儿均因及时确诊病情，及时实施相应的治疗措施干预，无明显症状。HPA、PCD、MCCD患儿因及时治疗，体格、智力发育正常，因PCD是由SLC22A5基因突变造成肉碱转运体（OCTN2）蛋白功能缺陷所致，治疗的关键在于补充C0，而MCCD可以参与生物素代酶缺乏和参与生物素代谢的全羧化酶合成酶缺乏所致，表现为难治性皮肤损害、神经系统损害和代谢性中毒，治疗的关键在于补充机体生物素水平。 不同季节、性别、出生体质量、孕周确诊IMD率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 不同季节、性别、出生体重、孕周确诊IMD情况对比[n(%)]

3 讨论

IMD是一类主要由氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢异常所致的代谢功能缺陷的遗传病，能诱发机体重要生物物质缺失、代谢物沉积等，导致患者出现神经系统异常、代谢性酸中毒、酮症等多种临床症状，多见于儿童时期，病情呈缓慢进行性进展[8-10]。IMD可影响患儿的生长发育，其中经典的IMD苯丙酮尿症出生时一般无特异性临床表现，但出生3个月后患儿会出现生长发育、智能落后，随着年龄不断增长而逐渐加重，病情严重时患儿的智商不足50[11-13]。早期准确筛查IMD，明确诊断，实施有效治疗措施干预，是规避小儿发育不可逆风险的重要手段。因IMD病种较多，常规使用细菌抑制法、荧光法等检查一次实验仅能检测出一种疾病，工作量大，筛查效率较低，无法满足临床需求[14-16]。

串联质谱分析中数据的采集是通过中性粒子丢失、母离子扫描和多反应监测3种模式来完成，基本原理是将分析物电离成质荷比不同的带电离子，将电磁学原理分离离子，并测定离子峰值强度，经与内标液队徽，定量分析标本中的物质浓度，检测水平能达到pg级，可在短时间内通过一种检测筛查出多种疾病，具有检测效率高、操作简单方便、所需样本量微小、准确率高等优点[17-18]。该研究中，12 409例新生儿经串联质谱技术筛查出高度疑似IMD 352例（2.83%），其中确诊3例（0.02%），均为足月分娩儿，其中HPA 1例、PCD 1例、MCCD 1例。随访1年，3例患儿均因及时确诊病情，及时实施相应的治疗措施干预，无明显症状，不同季节、性别、出生体质量、孕周确诊IMD率比较差异无统计学意义，提示串联质谱技术能有效筛查出新生儿IMD，指导临床尽早治疗。因IMD是由机体部分受体或膜、酶等生物合成过程中出现遗传缺陷，造成体液、细胞中的毒性中间代谢产物大量聚集或必须代谢产物缺乏，引起氨基酸、乙酰肉碱等代谢产物增高。串联质谱技术通过干血滤纸片分析氨基酸、乙酰肉碱等，能筛查出脂肪酸代谢紊乱、氨基酸代谢紊乱、有机酸代谢紊乱等在内的共40余种IMD，临床应用价值较高[19-21]。但串联质谱技术检测结果可能会受到新生儿出生体质量、胎龄、采血时间等影响，存在一定的假阳性率，仪器价格昂贵且保养、操作费用相对较高，在基层医院推广受到一定的限制。周伟等[22]对徐州地区新生儿遗传代谢疾病筛查显示，165 262例新生儿中筛查可疑阳性例数为3 344例，召回率为91.23%，其中确诊IMD 94例（0.06%），包含12例原发性肉碱吸收障碍，5例母源性肉碱吸收障碍，12例甲基丙二酸血症，1例戊二酸血症Ⅰ型，2例戊二酸血症Ⅱ型，52例苯丙酮尿症，其他11例。该研究中，阳江地区的IMD发病率与上述统计结果相比相对较低，这可能与阳江地区区域性有关（阳江是广东省经济欠发达地区，多年来外来人口少，该研究的12 409例新生儿父母双亲绝大多数都是当地居民，19间分娩医院覆盖了阳江市各个区、县）。该研究因研究时间和精力有限，结果仍存在一定的不足之处，如未与他人研究结果相对比、随访时间较短等，后期仍需加大样本量深入研究。

综上所述，早期行串联质谱技术检测能有效筛查出IMD，指导临床治疗，对于提高新生儿生存质量具有重大意义。