炎症性肠病患者艰难梭菌感染的流行情况及危险因素研究

伍众文 刘平娟 郭鹏豪 陈怡丽 廖康 黄彬

炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）可以分为克罗恩病（Crohn's disease，CD）与溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）。目前两种疾病患者艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）的流行情况和危险因素不同研究结论差异较大［1-7］。艰难梭菌的无症状携带/定植（asymptomatic carriage/Colonization，下文统称定植）是CDI 的危险因素［8］，是艰难梭菌传播的重要途径，但目前国内IBD 患者的定植情况未有文献报道。因此，需要建立完善的艰难梭菌感染、定植检测方法，调查国内IBD 患者的艰难梭菌流行病学及危险因素情况，为其诊疗提供依据［9］。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

GeneXpert 全自动医用PCR 分析系统和GeneXpert C.difficile 检测试剂盒（实时荧光PCR 法）购自美国Cepheid 公司。厌氧产气袋购自英国OXOID 公司。mini VIDAS 全自动免疫分析仪和艰难梭菌谷氨酸脱氢酶检测试剂盒（GDH，酶联免疫荧光法）以及艰难梭菌毒素A/B 检测试剂盒（CDAB，酶联免疫荧光法）、艰难梭菌显色培养基（CDIF）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Vitek MS）和基质液CHCA 均购自法国生物梅里埃公司。

1.2 纳入标准和排除标准

纳入标准：2017年11月至2019年6月，结合临床实验室检查、影像学检查、内镜和组织病理性，诊断为UC 或克罗恩病（CD）的住院患者。排除标准：IBD 分型不能确定患者；入院48 h 内粪便未能收集，病史不完整患者。研究经过院伦理委员会批准。研究对象为群体数据，并非具体病例无须知情同意。

1.3 艰难梭菌感染、定植和阴性诊断标准

根据《中国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识》［10］和美国IDSA 指南［11］，将GDH 与CDAB同时阳性，或B 毒素分子检测阳性，且腹泻次数≥3次/天或肠梗阻患者诊断为感染；粪便检测四项其中有一项阳性但无腹泻或肠梗阻患者诊断为定植；无艰难梭菌检测结果阳性患者诊断为阴性。

1.4 实验流程

留取入院诊断为IBD 患者住院48 h 内的大便，分为四份（每份约1 mL），分别用于以下检测：免疫荧光法检测GDH、CDAB，实时荧光PCR 法检测艰难梭菌B 毒素、二元毒素和高产毒RT027 菌株的tcdC基因，显色培养法培养艰难梭菌。查阅患者电子病历，登记患者各项指标。

1.5 谷氨酸脱氢酶检测方法

①200 μL 粪便加入1 000 μL 预处理液（R1）；②充分震荡混匀后，3 000 r/m 离心10 min；③取上清液300 μL 加入测试条上机检测，根据cut-off 值（阴性：检测值＜0.10；阳性：检测值≥0.10）判读结果。

1.6 艰难梭菌A/B 毒素检测方法

操作同GDH，根据cut-off值（阴性：＜0.13 ng/mL；灰区：（0.13～0.37）ng/mL；阳性＞0.37 ng/mL）判读结果。

1.7 实时荧光PCR 法

①拭子挑取少量标本并插入处理液小瓶中；②震荡混匀后将全部液体转移至Gene Xpert C.difficile Assay 检测试剂盒中，然后上机检测。检测标本中艰难梭菌的毒素B、二元毒素和缺失nt117 的tcdC 基因序列。

1.8 显色培养法

取粪便标本约300 μL 与等体积95%乙醇振荡混匀，室温静置1 h，3 000 r/m 离心5 min，用无菌棉签取上述预处理标本沉淀接种于显色培养基，置于37℃厌氧培养24～48 h。挑取边缘不规则，扁平干燥，伴有“马粪”臭味，黑色典型菌落进行鉴定。

1.9 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；计量资料符合正态分布以（）表示，采用t检验；不符合正态分布采用M（P25，P75）表示；两项比较指标有一项或两项不符合正态分布采用秩和检验统计学方法；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者一般情况比较

克罗恩病组（CD）和溃疡性结肠炎组（UC）例数分别为80（61.5%）和50（38.5%），定植率和感染率克罗恩病患者分别为20.0%和8.8%，溃疡性结肠炎患者分别为16.0%和26.0%。IBD 患者总体艰难梭菌定植率与感染率分别18.5%［（16+8）/130］和15.4%［（7+13）/130］。两组年龄、活动期重度比例、巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）、EB 病毒感染率、3 个月内激素、抗生素使用率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 一般情况比较［n（%），（±s）］Table 1 General differences between CD and UC group［n（%），（±s）］

表1 一般情况比较［n（%），（±s）］Table 1 General differences between CD and UC group［n（%），（±s）］

项目性别分组男女t/χ2值0.095 P 值0.758年龄活动期-4.817-5.772 0.000 0.000 38.6160.000分组腹泻次数缓解期轻度中度重度(空白)阴性定植感染少于3 次3～4 次5～7 次多于等于8 次-1.950 0.327 7.033-5.355 0.051 0.567 0.008 0.000发热CMV EB激素单抗免疫抑制剂抗生素克罗恩病组（n=80）47（58.8）33（41.3）29.1±11.1 8（10.0）17（21.3）46（57.5）1（1.3）8（10.0）57（71.3）16（20.0）7（8.8）49（61.3）25（31.3）6（7.5）0（0.0）13（16.3）4（5.0）7（8.8）7（8.8）8（10.0）18（22.5）19（23.8）溃疡性结肠炎组（n=50）28（21.5）22（16.9）39.7±13.8 0（0.0）4（8.0）22（44.0）22（44.0）2（4.0）29（58.0）8（16.0）13（26.0）10（20.0）20（40.0）12（24.0）8（16.0）10（20.0）12（24.0）21（42.0）18（36.0）4（8.0）7（14.0）20（40.0）0.297 10.292 20.129 14.710 0.146 1.431 3.869 0.586 0.001 0.000 0.000 0.703 0.232 0.049

2.2 患者大便检测情况

两组大便血红蛋白阳性率（OB）、转铁蛋白阳性率（TF）、大便WBC 比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组四种艰难梭菌检测方法阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 大便检测比较［n（%）］Table 2 Stool examination differences［n（%）］

2.3 患者炎症标志物比较

两组静脉血白细胞计数（WBC）、C 反应蛋白（CRP）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 炎症指标比较［（±s），M（P25，P75）］Table 3 Inflammatory biomarkers differences between CD and UC group［（±s），M（P25，P75）］

表3 炎症指标比较［（±s），M（P25，P75）］Table 3 Inflammatory biomarkers differences between CD and UC group［（±s），M（P25，P75）］

项目ESR WBC CRP n 126 129 121克罗恩病组47.5±29.5 6.9（5.28，9.37）28.2（12.43，47.20）溃疡性结肠炎组38.5（18.75，62）8.3（6.55，10.92）11.5（4.20，37.05）Z 值-0.849-2.789-2.553 P 值0.396 0.005 0.011

2.4 艰难梭菌不同检测方法结果

指南推荐联合方法结果与tcdB 法比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。二元毒素（CDT）与O27高毒株检测均为阴性。见表4～5，图1。

表4 4 种检测方法的结果Table 4 4 methods result

表5 tcdB 与联合法结果比较Table 5 differences between tcdB and union method］

图1 艰难梭菌四种检测方法的结果Figure 1 4 methods result

3 讨论

临床开展的检测艰难梭菌的方法有谷氨酸脱氢酶免疫学检测（GDH）、艰难梭菌A/B 毒素免疫学检测（CDAB）、艰难梭菌基因分子检测（NAAT）、艰难梭菌培养。指南推荐以GDH 和CDAB 联合为基础，NAAT、产毒培养（TC）或细胞毒试验确证（CCTA）的联合法［10］。研究发现由于CDAB 的阳性率低下，大量标本需要再进一步检测，所以单用tcdB 检测是临床检测更好的选择。

国内艰难梭菌感染率情况根据文献报道：IBD人群整体感染率范围在5.0～13.9%；UC 的范围在5.56%～22.8%；CD 的范围在4.0%～20.45%［2-7］。研究发现患者整体的艰难梭菌感染率为15.4%，溃疡性结肠炎（UC）感染率为26.0%，克罗恩病（CD）感染率为8.8%，与浙江邵逸夫医院报道感染率13.9%、24.7%和8.5%接近［7］。与一些报道［3，12-13］结果差异较大可能是检测方法差异导致的，尤其是一些单纯CDAB 检测报道。

与症状明显的艰难梭菌感染相比，艰难梭菌的定植往往遭到临床的忽视。在中国，上海市报道健康人群艰难梭菌定植率为0.70%［14］，台湾报道入院患者艰难梭菌定植率达20.0%［15］。对于IBD 人群，国外有研究发现儿童患者，定植率可达10.8%～17%；临床缓解期、无激素、抗生素、免疫抑制剂使用史，近期住院史患者产毒菌株定植率达8.2%［16］。实验发现IBD患者定植率为18.5%，其中UC 患者定植率为16%，CD 患者为20%（两者定植率没有统计学差异），据笔者所知是中国IBD 人群定植情况的首次报道。

艰难梭菌定植有重要临床意义，根据患者携带菌株是否携带产毒基因，可分为产毒菌株携带和非产毒菌株携带［17］。产毒菌株的携带不但能造成艰难梭菌的传播，而且会加大携带者自身感染的风险［8］；与之相反，非产毒株携带通过激活机体免疫系统，能降低携带者艰难梭菌感染风险［18］。这也凸显了tcdB 的独特价值，它是一种简便且能区分产毒与非产毒菌株定植的临床检测方法。

因为客观条件的限制，本研究没有采用参考方法（产毒培养或细胞毒试验）检测，艰难梭菌感染/定植分组可能会有偏差；由于是查阅患者病历的回顾性研究，一些危险因素（如质子泵抑制剂、住院史、胃肠手术史、IBD 评分等）因采集不完整而没有纳入研究；因是单中心研究，样本数量有限，可能没有全面地揭示患者真实情况。