量子点纳米材料探针及其在肿瘤影像中的应用

孙溥临

摘 要：针对现有量子点影像探针存在荧光性质不可控、生物毒性强的问题，本研究结合现有的CuInS量子点探针，研究制备出一种掺杂Zn离子可简易合成的ZCIS/ZnS量子点纳米探针，并通过改进其水溶性，得到一种可直接应用于医学肿瘤影像的改进ZCIS/ZnS量子点纳米探针。为提高该量子点纳米探针的靶向性，研究根据EDC偶联的原理，通过将改进ZCIS/ZnS量子点纳米探针与cRGD多肽进行偶联，得到ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针，并从结构形态、细胞毒性和离体荧光3个方面重点评估了该量子点纳米探针，并通过实验论证了其有效性和实用性。实验结果证明，本研究制备的ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针是一种有效的肿瘤靶向探针，可用于实际肿瘤靶向检测。

关键词：CuInS;量子点;纳米材料;荧光成像

中图分类号：R329.2+6;Q26  文献标识码：A     文章编号：1001-5922（2021）10-0058-04

Quantum Dot Nanomaterial Probe and Its Application in Tumor Imaging

Sun Pulin

（School of Mechanical Engineering，Shandong University of Technology， Zibo 255000， China ）

Abstract：In view of uncontrollable fluorescence properties and strong biological toxicity of existing quantum dot image probes，this study combines the existing CuInS quantum dot probes to prepare a ZCIS/ZnS doped with Zn ions that can be easily synthesized Quantum dot nanoprobe， and by improving its water solubility， an improved zcis/ZnS quantum dot nano probe can be directly applied to medical tumor imaging. In order to improve the targeting property of the QD nanoprobe， according to the principle of EDC coupling， the ZCIS/ZnS cRGD QD nanoprobe was obtained by coupling the modified ZCIS/ZnS QD nanoprobe with CGD peptide. The QD nanoprobe was evaluated from three aspects of structure morphology， cytotoxicity and fluorescence in vivo imaging， and its effectiveness and practicability were demonstrated by experiments. The experimental results show that the ZCIS/ZnS-cRGD quantum dot nanoprobe is an effective tumor targeting probe， which can be used for tumor targeted imaging in vivo.

Key words：CuInS; quantum dots; nanomaterials; fluorescence imaging

量子点作为一种新型纳米材料，由于其优良的光学性质，被广泛应用于生物标记。如刘蓓蓓、曹林（2019）建立了基于量子点的铅镉快速串联检测方法，用于检测肉中的Pb和Cd含量是否超标等[1]。但由于铅镉本身属于重金属，因此基于这两种元素的量子点具有潜在的生物毒性，故限制了它们在荧光活体成像方面的应用。近几年，随着量子点材料的发展，具有较低生物毒性的CuInS量子点材料在荧光活体成像方面得到快速发展，如冯彩萍、單路瑶等（2020）基于Fe3O4&CuInS2核壳结构构建了双模式成像系统，实现了可视化治疗[2]。但这些研究中量子点仍然存在荧光性质不可控的问题。为解决该问题，本研究结合现有的CuInS量子点探针与EDC偶联的原理，制备出一种荧光性质稳定，且生物毒性较低的ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

本研究实验主要使用到的仪器及其型号和生产厂家如表1所示，实验中使用到的试剂和生产厂家如表2所示，试剂规格均为分析纯。

1.2 实验过程

1.2.1 量子点探针制备

（1）ZCIS量子点制备。步骤1：称取76.8mg碘化亚铜、117.2mg醋酸铟、126.4mg硬脂酸锌依次加入含冷凝管的100ml四口烧瓶中，并加入16ml十八烯、0.2ml油酸、2ml巯基十二烷混合。在氩气环境中使用磁力搅拌将反应体系加热到100℃。同时，利用真空泵持续对反应体系抽真空30min，每间隔8min回充和置换一次氩气。步骤2：持续加热反应体系至240℃，并维持该温度到一定时间，可以观察到反应溶液随时间延长，颜色逐渐由淡黄色变成黄色、橙色、红色、棕红色直到黑色。为后续测试反应溶液的表征，在反应体系加热过程中，每间隔5min需借助注射器从反应液中抽取少量溶液，并快速稀释冷却置于环己烷中。步骤3：维持加热温度240℃持续加热70min后，将反应溶液置于自然条件下冷却至室温，并向溶液中加入3倍体积的过量乙醇/环己烷混合溶剂。采用8000g离心处理混合溶液20min，去除多余的副产物和反应前体，可得到纯化的ZCIS量子点。

（2）改进ZCIS/ZnS量子点制备。步骤1：称取32mg硫粉，在超声波的条件下，将硫粉溶解于8ml十八烯与2ml油胺的混合溶液中，得到棕红色硫前体液。称取380mg硬脂酸锌，在超声波的条件下使其溶解于6ml的十八烯溶液中，得到白色浑浊状态的锌前体液;步骤2：将不进行任何处理的ZCIS量子点的反应溶液温度降低到150℃。依次向溶液中加入4ml硫前体液和6ml锌前体液，并将混合溶液加热到220℃，并保持温度使混合溶液持续反应1h后，将反应溶液置于自然条件下冷却至室温;步骤3：采用8000g离心处理混合溶液20min，去除多余的副产物和反应前体，可得到纯化的ZCI/ZnS量子点，将其保存在三氯甲烷中;步骤4：向上述制备得到的含有20nmol ZCIS/ZnS量子点的三氯甲烷溶液中加入8mg的PMAO，将混合溶液在室温条件下使用磁力搅拌剧烈搅拌3h。加入40μl的乙醇胺并继续搅拌30min，再加入4ml硼酸缓冲液，利用旋转蒸发完全去除溶液中的三氯甲烷，得到含有量子点的澄清透明水溶液;步骤5：采用100000g离心对含有量子点水溶液进行超速离心处理30min，重复3次，去除溶液中的多余反应物以及三氯甲烷。将改进后的ZCIS/ZnS量子点溶解于400μl的PBS中，以便用作后续实验。

（3）ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针制备。ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针的制备方法主要是利用EDC偶联的原理[5]，将改进后的ZCIS/ZnS量子点与cRGD多肽进行偶联，其具体操作如下：

步骤1：将10nmol改进后ZCIS/ZnS量子点和10μmolEDC在400μl的PBS中进行混合，将混合溶液在避光室温条件下进行震荡，震荡时长为15min;步骤2：向混合溶液中加入一定量的粉末状cRGD，并在避光的室温条件下震荡2h;并采用100000g超速离心处理溶液30min，重复2次，去除多余的反应物，得到纯化的ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针。

1.2.2 ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针性能测试

（1）细胞毒性测试。借助MTT实验[6]对白鼠成纤维细胞系NTH-3T3进行表征，以检验ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针的细胞毒性测试。具体操作如下：

步骤1：取含有10%胎牛血清的DMEM培养液与处于对数生长期的NIH-3T3细胞混合配置成细胞悬浮液。向48孔边缘孔为无菌PBS填充的細胞培养板中，加入每孔200μl的细胞悬浮液，种植密度为每孔5000个细胞。在二氧化碳含量为5%，温度为37℃的细胞培养箱中进行培养，培养时长12h;步骤2：向含有细胞悬浮液的孔板中加入不同浓度的ZCIS/ZnS量子点DMEM溶液，并在二氧化碳含量为5%，温度为37℃的细胞培养箱中进行培养，培养时长24h，其中，每个浓度的ZCIS/ZnS量子点DMEM溶液需设置3个复孔;步骤3：向每孔中加入40μl的MTT溶液，培养4h后倒出培养液。加入300μl的二甲基亚砜，在避光低速的摇床上震荡10min，直到结晶物完全溶解。采用酶联免疫检测仪检测每孔的吸光值。

（2）离体荧光信号测试。本研究的荧光活体成像实验是以白鼠脑胶质瘤为例展开的实验[7]，具体操作如下：

步骤1：选择两组7周龄大小、体重为25g左右的雌性裸鼠20只，每组10只，在其右上肩部，采用皮下注射的方式，注射100μl含100万个肿瘤细胞的PBS细胞悬浮液。约3周后，裸鼠体内肿瘤体积增长到5mm×5mm时，即可用于荧光活体成像实验;步骤2：实验前12h，停止喂食待用裸鼠，以尽量减少因食物的荧光造成的干扰。采用尾静脉注射的方式，向第一组裸鼠注射含100μl的ZCIS/ZnS量子点PBS溶液，向第二组裸鼠注射含100μl的ZCIS/ZnS-cRGD量子点探针PBS溶液;步骤3：设置Carestream MSFX PRO荧光活体成像系统CCD的曝光时间为20s，激发波长510nm，发射波长为700nm。在不同时间点，使用该系统对注射量子点探针的老鼠进行荧光成像;步骤4：注射6h后杀死实验老鼠并取出其肝、胃等主要脏器用作荧光成像，并利用成像系统的图像处理软件完成数据采集及分析[8]。

1.3 性能测试

1.3.1 HRTEM结构形貌分析

对稀释在三氯甲烷中的纯化ZCI/ZnS量子点进行超声分散处理，取处理后的溶液10μl置于超薄碳膜的TEM测试铜网上，直到溶剂全部挥发。利用HRTEM对量子点结构和形貌进行表征。

1.3.2 XRD结构分析

取0.1ml分散于三氯甲烷中的纯化后量子点均匀涂抹与晶体硅片上，待溶剂完全挥发，再次涂抹同体积的溶液，重复3次。利用XRD进行量子点晶体结构分析。

2 结果与分析

2.1 ZCIS/ZnS量子点的XRD图

使用XRD对ZCIS和ZCIS/ZnS量子点进行结构表征，得到如图1所示的结果。由图1可知，ZCIS和ZCIS/ZnS量子点在XRD图谱上均存在3个衍射主峰，ZCIS/ZnS的衍射主峰相较于ZCIS出现了一定红移，说明Zn离子成功引入量子点，本研究成功制备了ZCIS/ZnS量子点。

2.2 改进ZCIS/ZnS量子点光学性质

利用HRTEM对改进ZCIS/ZnS量子点的光学性质进行表征，得到如图2所示的结果。由图2可知，改进的ZCIS/ZnS量子点的荧光性质与ZCIS/ZnS量子点的荧光性质相比，几乎没有发生变化。

2.3 ZCIS/ZnS-cRGD量子点细胞毒性评估

通过MTT实验对ZCIS/ZnS-cRGD量子点细胞毒性进行评估，将不同浓度的ZCIS/ZnS-cRGD量子点与NIH3T-3细胞共同孵育48h，得到如图3所示的结果。由图3可知，当ZCIS/ZnS-cRGD量子点浓度小于0.8μmol时，细胞的存活率维持在87%以上，说明本研究制备的ZCIS/ZnS-cRGD量子点具有较低的毒性，可用于后续医学研究和应用。

2.4 离体荧光信号强度测量

为进一步分析ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针的代谢能力，在注射该探针5h后，解剖第二组裸鼠取出其主要脏器，并对其进行离体荧光成像和半定量分析，得到如图4所示的结果。由图4可知，肝脏、胃的荧光信号最强，其原因是RES能识别并捕获ZCIS/ZnS-cRGD信号，因此肝脏的ZCIS/ZnS-cRGD信号强度最强;胃部残留的食物含有大量的荧光信号，因此胃部的荧光强度相对较高。而相比于其它脏器，肿瘤的荧光强度最强，说明本研究制备的ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针是一种有效的肿瘤靶向探针，可用于实际肿瘤靶向检测。

3 结论

根据上文研究，可以得到以下4点结论：

（1）ZCIS/ZnS量子点在XRD图谱上均存在3个衍射主峰，且相较于ZCIS量子点出现了一定红移，说明本研究成功引入了Zn离子，制备得到了ZCIS/ZnS量子点。

（2）改进ZCIS/ZnS量子点纳米材料具有良好的亲水性和荧光性质，可直接应用于医学影像。

（3）ZCIS/ZnS-cRGD量子点浓度小于0.8μmol时，细胞的存活率维持在87%以上，即本研究制备的ZCIS/ZnS-cRGD量子點具有较低的毒性。

（4）ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针可明显检测到实验裸鼠的肿瘤部位信号，且随着时间的延长，肿瘤的轮廓更加清晰，即本研究制备的制备的ZCIS/ZnS-cRGD量子点纳米探针具有良好的肿瘤特异性识别能力，是一种有效的肿瘤靶向量子探针，可用于实际肿瘤靶向的活体成像。

参考文献

[1]刘蓓蓓，曹林.基于量子点建立铅镉快速串联检测方法[J].食品科学，2019，40（18）：335-341.

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