下调IncRNA ZFAS1通过miR-302-3p调节CCND1抑制甲状腺癌的机制研究

陈文静 翟丽丽 刘惠铭 于兵 崔博舒 曾小轩 郭慧琦 樊伟业

摘要：目前，甲状腺癌的治疗选择仍然有限。本研究旨在调查ZFAS1在癌症的各种主要特征中的作用以及甲状腺癌细胞的潜在机制。通过生物信息学预测并通过进行双荧光素酶测定法研究长链非编码RNA（lncRNA），microRNA（miRs）和靶基因之间的相互作用。通过逆转录定量PCR和蛋白质印迹法测定mRNA和蛋白质表达。分别通过Transwell实验，创伤修复和Cell Counting Kit-8（CCK8）分析评估细胞的侵袭，迁移和增殖活力。结果表明，lncRNA ZFAS1在甲状腺癌组织，TT和SW579细胞中表达上调，并且与这两种细胞系的增殖有关。值得注意的是ZFAS1的下调降低了细胞的迁移和侵袭能力，并拮抗了miR-302a-3p抑制剂对TT和SW579细胞增殖，迁移和侵袭的促进作用。此外，ZFAS1通过调控miR - 302a - 3p靶向影响cyclin D1 （CCND1），并且ZFAS1的下调不仅逆转了miR-302a-3p抑制剂对CCND1表达以及TT和SW579细胞上皮间质转化（EMT）的促进作用，而且还靶向并增加了miR-302a- 3p的表达，并进一步降低CCND1的表达，从而抑制甲状腺癌细胞的增殖，迁移，侵袭和EMT。

【中图分类号】R736.1 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）11--04

甲状腺癌是内分泌系統常见的恶性肿瘤之一（1），在许多地区（1，2），例如美国（3）、韩国（4）和南欧国家（5）发病率最高。根据美国癌症协会的最新数据，2019年有甲状腺癌52，070例新增病例和2170例死亡病例（3）。根据其病理特征，甲状腺癌可分为乳头状甲状腺癌，滤泡性甲状腺癌，甲状腺髓样癌和未分化甲状腺癌（6）。目前，分化型甲状腺癌的治疗方法主要是手术切除，抑制甲状腺激素，放射性碘治疗和分子靶向治疗（7）。然而，由于甲状腺癌的强侵袭性和迁移性及其高度恶性，治疗后许多患者经常发生复发或远处转移（8）。因此，研究甲状腺癌转移的分子机制及甲状腺癌分子标记和靶标对于癌症的治疗极其重要。

长链非编码（lnc）RNA是长度> 200个核苷酸且没有蛋白质编码功能的RNA。IncRNA可以调节许多生物学过程。lncRNA参与人体生长和发育以及多种疾病的发生，例如癌症（10）及肾小球和肾小管间质性肾脏病（11）。先前的研究表明，lncRNA广泛转录和调控基因组，各种lncRNA在染色质重塑、转录、切割和翻译等多种生物过程中起着重要作用（12）。肿瘤的基因表达谱表明了lncRNA在肿瘤中的异常表达，说明lncRNA参与了肿瘤发生的一般机制（13，14）。

ZFAS1在动脉粥样硬化（15）和卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和肝细胞癌（16-19）等多种癌症中起作用。 ZFAS1是预测甲状腺癌预后的可能生物标志物（20）。 Han等人（20）研究表明（hsa）-microRNA（miRNA / miR）-150-5p和hsa-miR-590-3p是甲状腺癌细胞中与ZFAS负相关的内源RNA。ZFAS1通过使miR-590-3p变海绵并增加高迁移率AT-hook 2的表达来促进甲状腺乳头状癌的发展（21）。 IncRNA使不同的miRNA发挥调节细胞功能的作用（22）。此外，据报道miR-302a-3p在肝细胞癌（23）和胰腺导管腺癌（24）等多种疾病中起作用。长基因间非蛋白编码RNA（LINC）01016通过调节miR-302a-3p / miR-3130-3p /核转录因子Y亚基α/ SATB同源盒1轴来促进子宫内膜癌细胞的发生（25）。另外，miR-302a-3p通过抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭来抑制肝细胞癌的发展（23）。但是， miR-302a-3p在甲状腺癌中的作用尚未报道过。

本研究调查了ZFAS1在甲状腺癌细胞的增殖，迁移，侵袭和上皮-间质转化（EMT）中的作用，并探索了下游miRNA和靶基因，通过该基因ZFAS1对甲状腺癌细胞发挥了调节作用。

1材料和方法

本研究得到齐齐哈尔市第一医院伦理委员会批准（批准号：QR20180503112）。从患者（年龄范围：28-65岁;男性，11;女性：19）中提取癌及邻近组织（距癌组织≥5 cm）的样本（n = 30）。本研究的患者纳入标准如下：通过病理检查确定为甲状腺癌的患者;以及术前未接受放疗或化疗的患者。根据ZFAS1的中位表达值，将患者分为低表达组和高表达组。

1.细胞培养

Nthy-ori3-1（上海亚吉生物科技有限公司）（26），MDA-T68 [American Type Culture Collection（ATCC）]（27），SW579（ATCC）（28），B-CPAP（中国科学院细胞库）（29）和TPC-1（中国科学院典型培养物保藏库）（30）细胞系将其在RPMI 1640（目录号21875091; Thermo Fisher Scientific，Inc）中培养。 TT细胞（ATCC）（28）在DMEM（目录号D0819; Sigma-Aldrich; Merck KGaA）中培养。培养基均含有10%FBS（目录号F8192; Sigma-Aldrich; Merck KGaA），37°C，5%CO2孵箱下孵育。

2.实验设计

研究使用小干扰（si）RNA下调ZFAS1表达的效果，将TT和SW579细胞分为以下几组：1）对照（无转染）;2）si-Control（用50 nM si-Control转染）;3）si-ZFAS1（用50 nM si-ZFAS1转染）。 si-Control（5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）和si-ZFAS1（5'-CUAACUGCCUACCUGCAUATT-3'）购自上海基因制药有限公司，并用Lipofectamine?3000（目录号：No. L3000015; Thermo Fisher Scientific，Inc.）。为了在甲状腺癌的特征上明确miR-302a-3p和ZFAS1之间的联系，将TT和SW579细胞分为以下几组：1）对照（无转染）; 2）抑制剂阴性对照（NC;转染50 nM miR-302a-3p抑制剂-NC; 3）抑制剂（转染50 nM miR-302a-3p抑制剂）;4）抑制剂+ si-ZFAS1（用50 nM miR-302a-3p抑制剂和50 nM si-ZFAS1转染）; 5）si-ZFAS1（用50 nM si-ZFAS1转染）。 miR-302a-3p抑制剂-NC（5'- CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'）和miR-302a-3p抑制剂（5'- UCACCAAAACAUGGAAGCACUUA-3'）购自上海基因制药有限公司，细胞（2x104个细胞）使用Lipofectamine?3000（目录号L3000015; Thermo Fisher Scientific，Inc.）转染/孔; 96孔板）。细胞培养24小时。

3.逆转录定量（RT-q）PCR

使用试剂（目录号15596018;赛默飞世尔科技公司）从组织样品和细胞（1x106个细胞）中提取总RNA。对于miRNA分析，使用TaqMan?MicroRNA逆转录试剂盒（目录号4366597; Thermo Fisher Scientific，Inc.）根据制造商的规程，对200 ng总RNA进行cDNA合成。逆转录条件包括：42℃30分钟和85℃5分钟。使用2μlcDNA溶液，5μlTaqMan 2X Perfect Master Mix（Takara Biotechnology Co.，Ltd。），0.25μl基因特异性引物和2.75μl无核酸酶的水进行定量PCR反应，最终体积为10μl。一个Bio-Rad IQ5热循环仪（Bio-Rad Laboratories，Inc.）在以下条件下：在95°C下初始变性3分钟，然后在95°C下进行40循环30秒，在62°C下进行30秒和72次?C25秒。 U6基因用作内部对照。为了进行mRNA分析，使用PrimeScript RT试剂盒（Takara Biotechnology Co.，Ltd。）将mRNA模板逆转录成cDNA。逆转录条件：37°C 30分钟和85°C 5分钟。根据FastStart?Universal SYBR Green Master的协议（Rox;目录号4913850001; Roche Diagnostics），14μl2X SYBR Green主混合物，1μl正向引物（10μM），1μl反向引物（10μM），将3μlcDNA模板和6μl双重蒸馏的H2O混合并在Bio-Rad IQ5热循环仪（Bio-Rad Laboratories，Inc.）中在以下条件下反应：95°C持续90秒，95°C持续25秒，65 ?C持续20秒，72 30C持续30秒，持续40个循环。 GAPDH用作内部对照。 mRNA表达水平通过2-ΔΔCq法计算（31）。

4.Transwell分析

收集对数生长期TT和SW579细胞（1x106），并吸移到预先涂有Matrigel（BD Bioscience; 37°C）的Transwell插入物（8-μm）的上腔室（含无血清培养基）中。（持续4小时）。在下腔室中添加了在400μl培养基中混合的10%FBS。 Transwell在37°C和5%CO2中孵育24小时。接下来，用棉签除去保留在上腔室表面上的细胞，将侵袭的细胞在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟，然后在室温下用0.2%结晶紫染色10分钟。在光学显微镜下（放大倍数，×200）观察下腔室中的细胞，并使用Image J软件（1.8.0版;美国国立卫生研究院）对细胞进行计数。

5. 生物信息学和双荧光素酶報告基因分析

ZFAS1和miR - 302a - 3p以及cyclin D1 （CCND1）和miR - 302a - 3p之间的相互作用是由Starbase（版本2.0;http：//starbase.sysu.edu.cn）预估。ZFAS1和CCND1的突变体是使用快速改变位点定向突变试剂盒（安捷伦技术公司）构建的。编码荧光素酶报告基因的质粒pGL3购自Promega公司。构建了含有野生型（WT） ZFAS13，未翻译区（UTR）、野生型CCND13，UTR或相应突变序列的重组质粒。TT和SW579细胞（1 × 105细胞/孔）接种在24孔板中，并用miR - 302a - 3p mimic （40 nM;5' uaa gug cuu cca ugu uuu ggu ga ';上海基因制药有限公司）或miRNA对照（40 nM;5' uuc ucc gaa cgu guc acg utt 3';重组质粒（20 ng）或相应的突变体（20 ng）使用Lipofectamine 3000。质粒pRL胸腺嘧啶激酶;作为荧光素酶的内参。在使用Dual - Glo荧光素酶检测试剂盒（Promega Corporation）检测荧光素酶活性之前，细胞培养48小时。荧光素酶活性归一化为Renilla荧光素酶活性。

6.伤口愈合试验

在对数生长期收集TT和SW579细胞（1 × 106）。用无菌的200?l移液管尖端在单层细胞上划痕，在细胞层中间形成一个间隙。洗涤后，用无血清培养基处理细胞48小时，并在37?C的5% CO2中孵育。使用光学显微镜（放大率，x100）捕捉图像，并通过ImageJ软件1.8.0（美国国立细胞计数试剂盒- 8 （CCK - 8）检测。si - ZFAS1或miR - 302a - 3p抑制剂转染TT和SW579细胞（1 × 106），分成组（对照、si -对照、si - ZFAS1、抑制剂- NC、抑制剂、抑制剂+ si - ZFAS1）培养24、48和72小时。通过CCK - 8检测细胞活力Cat.no.96992 - 100测试- F;σ-奥尔德里奇;默克公司（Merck KGaA）。采用Multiskan酶标仪（Thermo Fisher Scientific， Inc.）在450 nm处测定吸光度。

7.Western-blotting

细胞转染24小时后，获得1 × 106个细胞，并用RIPA裂解液裂解与蛋白酶抑制剂测定总蛋白浓度。用12% SDS - PAGE将蛋白（25?g/lane）分离，然后转移到PVDF膜上。室温下用5%脱脂乳封闭膜1小时，并与抗周期蛋白D1 （1：10000）; MMP2 （1：1000）;E - cadherin （1：10000;N -钙粘蛋白（1?g/ml）;和GAPDH （1：10，000）（全部购自Abcam）一抗，在4?C过夜。然后用TBS - Tween 20 （0.1% Tween - 20）洗涤膜，并与山葵过氧化物标记的山羊抗兔二抗（1：2000）在室温下保存1小时。蛋白印迹是使用SignalFire?ECL试剂（cat.no.6883;Cell Signaling Technology， Inc.），并使用ImageJ软件（version 1.46）进行分析。

8.统计分析

数据表示为三个独立实验的平均值±SD。配对和未配对的两组之间的统计学差异通过t检验分析，多组之间的差异则是通过单向或双向方差分析（针对CCK-8数据）进行分析，然后进行Tukey事后检验。Pearson相关系数检验用于相关性分析，Fisher精确检验和X2检验用于分析不同变量之间的关联。 使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，Inc.）分析所有结果。 P <0.05认为统计学上显着差异。

2结果

甲状腺癌组织和细胞系中ZFAS1表達水平上调，并与甲状腺癌细胞的增殖呈正相关。为了研究ZFAS1在甲状腺癌中的表达和作用，检测了ZFAS1在肿瘤组织和细胞系中的表达水平。此外，测定了沉默表达ZFAS1的TT和SW579细胞的细胞活力。结果表明，与邻近组织相比，甲状腺癌组织中ZFAS1表达水平上调，与Nthy-ori3-1细胞相比，MDA-T68，TT，SW579，B-CPAP和TPC-1细胞中ZFAS1表达水平上调（P <0.01;图1A和B）。此外，分析了ZFAS1表达与临床特征之间的关联，结果表明ZFAS1表达水平与肿瘤大小，淋巴结状态和肿瘤分期显着相关（表I）。

在si-ZFAS1组中，相比于si-对照组，在TT和SW579细胞中ZFAS1表达水平显着降低（P <0.01;图1C和D）。值得注意的是，在24、48和72小时后，si-ZFAS1组的TT和SW579细胞的细胞活力明显低于si-对照组（P <0.05或P <0.01;图1E和F）。这些结果表明ZFAS1的表达水平在甲状腺癌中升高并且与甲状腺癌的增殖有关。

ZFAS1表达水平的降低会降低甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力。 si-ZFAS1转染了TT和SW579细胞，与si-对照组相比，si-ZFAS1组在24 h后TT和SW579细胞的迁移和侵袭率显着降低（P <0.01;图2），表明ZFAS1表达与甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力正相关。

生物信息学预测，miR-302a-3p是ZFAS1的靶基因（图3A）。与ZFAS1-WT +空白组相比，TT和SW579细胞中ZFAS1-WT +模拟组的相对荧光素酶活性显着降低（P <0.01;图3B和C）。 miR-302a-3p是ZFAS1的靶标。此外，结果表明与邻近组织相比，甲状腺癌组织中的miR-302a-3p表达水平显着降低（P <0.01;图3D），并且ZFAS1与miR-302a-3p的表达水平之间存在负相关关系（图3E）。另外，抑制剂组中miR-302a-3p的表达水平与抑制剂-NC组相比明显降低，但在抑制剂+ si-ZFAS1组中，与TT中的抑制剂组相比，其表达水平显着更高，SW579细胞（P <0.01;图3F和3G）。另外，与抑制剂+ si-ZFAS1组相比，si-ZFAS1组中的miR-302a-3p表达水平显着增加（P <0.01;图3F和3G）。这些结果表明ZFAS1可能靶向miR-302a-3p来调节甲状腺癌细胞的活性。

ZFAS1表达下调消除了miR-302a-3p抑制对甲状腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭的积极作用。为了研究ZFAS1和miR-302a-3p在甲状腺癌进展中的作用，研究了使用或不使用si-ZFAS1和miR-302a-3p抑制剂处理的甲状腺癌细胞的细胞活力，迁移和侵袭的变化。结果表明，与抑制剂-NC组相比，TT和SW579细胞抑制剂组的细胞活力以及迁移和侵袭率显着提高，而与+ Zi-ZFAS1组相比，它们显着降低。抑制剂组的那些（P <0.01;图4）。此外，与抑制剂+ si-ZFAS1组相比，si-ZFAS1组的细胞活力以及迁移和侵袭率显着降低（P <0.01;图4）。这些结果表明ZFAS1的下调可能会减弱miR-302a-3p在甲状腺癌中表达的降低。

miR-302a-3p靶向CCND1。通过生物信息学分析确定了ZFAS1和miR-302a-3p在甲状腺癌中发挥调节作用的基因。生物信息学分析预测，miR-302a-3p将CCND1靶向甲状腺癌的发生（图5A）。此外，双荧光素酶报告基因检测结果表明，与CCND1-WT +空白组相比，CCND1-WT +模拟组中TT和SW579细胞系的相对荧光素酶活性明显较低（P <0.01;图5B和C）。

ZFAS1表达水平的下调逆转了miR-302a-3p抑制剂对甲状腺癌细胞CCND1表达的促进作用。探讨了CCND1表达是否受ZFAS1和miR-302a-3p在TT和SW579细胞中的调控。结果表明，与抑制剂-NC组相比，抑制剂组的TT和SW579细胞中CCND1表达水平显着增加（P <0.01;图6）。另外，抑制剂+ si-ZFAS1组的CCND1表达水平与抑制剂组相比显着降低，但与si-ZFAS1组的CCND1表达水平显着升高（P <0.01;图6）。这些结果表明miR-302a-3p和CCND1的表达水平呈负相关，而ZFAS1和CCND1的表达水平呈正相关。

3讨论

本研究表明，在甲状腺癌组织和细胞系中ZFAS1表达增加，而ZFAS1表达的下调（可能通过影响CCND1的表达）通过抑制miR-302a-3p的表达降低了肿瘤细胞的增殖，迁移，侵袭和EMT。这些关于调节途径的新发现可能有助于甲状腺癌的干预措施。

参考文献：

[1]彭书旺， 陈露阳. lncRNA MIR31HG对甲状腺乳头状癌细胞增殖，迁移，侵袭的影响及作用机制研究[J]. 中国现代医学杂志， 2020， v.30（12）：19-27.

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[3]钟丽颖， 李顺东， 孙叶海. 长链非编码RNA PTV1通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制甲状腺癌细胞的增殖、侵袭及诱导凋亡[J]. 成都医学院学报， 2019， 014（004）：426-430.

项目：齐齐哈尔市科技计划创新激励项目 项目编号 CSFGG-2021016