金胺O荧光染结核杆菌褪色后行抗酸染色的结果分析

陈丹丹

(联勤保障部队第九〇〇医院，福建 福州 350001)

0 引言

近年来我国的结核病发病率呈增加趋势，而在临床判断结核病过程中，现以病理组织学的镜下结果，即典型病变部位行HE染色后可见朗格汉斯巨细胞，类上皮细胞及干酪样坏死组成的结核肉芽肿为特征和萋尼氏抗酸染色(Ziehl-Neelsen染色)作为其诊断的金标准[1-2]。对结核病人来说，及早快速的检出结核分枝杆菌，有助于其得到早期有效的治疗效果。现阶段，抗酸染色由于其具有特异性强，操作简单等优点，常用于临床诊断，尤其适合用于基层医疗单位诊断结核分枝杆菌感染病例[3]，金胺O荧光染色由于其敏感性较高，多用于抗酸染色的辅助诊断[4]。但由于金胺O荧光染色具有高敏感性，人员培训周期短等优势，现阶段，对临床疑似病例，多在第一时间就选取典型部位进行切片，进行金胺O荧光染色后得出诊断结果。但是，经长期多次实验发现，金胺O荧光染色存在假阳性的情况发生，易造成误诊。不仅仅延长病人的诊断周期，导致错误用药，同时也造成试剂浪费情况，增加不必要的医疗费用。如若疑似部位结核分枝杆菌存在范围小，多次制片将大大消耗待检组织。此时，在不易获得多个切片的情况下，可将经金胺O荧光染色的染色切片进行褪色处理可获得相同部位的抗酸染色结果。本实验选取疑似结核杆菌的病人，经金胺O荧光染色得出结果，而后对原有染色切片行褪色处理后再叠加抗酸染色，并比对结果进行分析。褪色处理后的金胺O荧光染色切片可获得真实的抗酸染色结果，不仅用于回顾性研究，必要情况下可再次验证金胺O荧光染色结果的真实性、可靠性。

1 材料和方法

1.1 材料

2017年9月至2018年9月，我科疑为结核杆菌感染的病例196例，其中男103例，女93例，年龄25-79岁，平均43岁。所有病例皆选取典型部位的石蜡组织块进行金胺O荧光染色，根据荧光染色的时间段，将以上病例人为的分为A(2017年9-12月)，B (2018年1-3月)，C (2018年4-6月)，D (2018年7-9月)四组。

主要仪器 荧光显微镜(OLYMPUS BX51)；普通光学显微镜(OLYMPUS BX41)；电热恒温水槽；

主要试剂 (1)抗酸染色检测试剂盒购自珠海贝索生物技术公司。(2)金胺O荧光染色液：金胺0.1g溶于95%酒精10mL，脱色剂为3%盐酸乙醇液；复染液为2.5%高锰酸钾溶液。(3)二甲苯和梯度(100%，95%，85%)酒精。(4)使用2.5%草酸溶液和充分水洗脱去金胺O荧光染色。

1.2 染色方法

(1)金胺O荧光染色法：首先将选取典型的石蜡块制成厚度为5μm的切片，经二甲苯及梯度酒精脱蜡至水，后将组织切片放入金胺O荧光染液中并置于65℃电热恒温水槽，染色时间设置为30min。后取出切片，流水冲洗5min，水洗后用3%盐酸乙醇液进行脱色，可根据颜色变化水洗1-3min不等，至外观无明显黄色为止。再次水洗后使用2.5%高锰酸钾溶液进行复染，水洗烤干，中性树脂经行封片，待检。荧光镜下可见结核杆菌菌体在黑色背景下呈现亮绿色，菌体形态清晰。(2)整理2017年9月至2018年9月的金胺O荧光染色片，取下盖玻片，至二甲苯及梯度酒精中进行短暂洗脱，流水冲洗5min。水洗结束后甩干多余液体，分别滴加足量2.5%草酸溶液，至外观无明显黄色为止，再次流水冲洗。(3)抗酸染色：按照Ziehl-Neelsen抗酸染色法常规操作流程进行染色，即先滴加足量石炭酸复红染液覆盖组织切面染色5min，该过程可进行加热处理，即将酒精灯置于玻片架下20cm处徐徐加热，至有少量蒸汽出现为止。若染液蒸发减少，徐加染液。染色过程应多于5min，待染液恢复室温后水洗。后滴入3%盐酸酒精液进行脱色，过程中可轻轻晃动玻片至无红色脱出为止，水洗。最后，用美兰染液复染1min，水洗，中性树脂封片，待检。结果判定：镜下见到鲜红色杆状、略弯曲、串珠状的抗酸杆菌为阳性。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用(±s)表示，比较采用t检验；计数资料以率(%)表示，比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本实验选取的疑似结核分枝杆菌感染的病例共196例，其中，临床结合病理诊断为结核分枝杆菌感染的病例共117例，设为结核组，金胺O荧光染色的阳性88例，阴性29例，阳性率为75.2%；诊断为非结核分枝杆菌感染的病例共79例，设为对照组，金胺O荧光染色阳性1例，阴性78例，阳性率为1.3%。将所有196例已金胺O荧光染色后的切片经脱色处理后，进行Ziehl-Neelsen抗酸染色，镜下符合结核分枝杆菌感染的共67例，阳性率为57.3%，见表1。

表1 金胺O荧光染色和褪色后行抗酸染色结果的比较[n(%)]

本实验送检196例病人中，男性103例，女性93例，年龄25-79岁，平均43岁。其中无论是金胺O荧光染色或是抗酸染色，两组患者的性别和年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P<0.05)。

本实验根据荧光染色的时间段，将196例接受金胺O荧光染色的切片人为的分为A (2017年9-12月)，B (2018年1-3月)，C (2018年4-6月)，D (2018年7-9月)四组。经褪色处理后，行抗酸染色发现，随着时间增加，金胺O荧光效果逐渐消退，但草酸试剂褪色效果好，同时不影响抗酸染色着色效果。镜检时，可见浅蓝色背景下，着红色，弯曲状的结核分枝杆菌呈灶性分布，四组染色效果相当。可推测出金胺O荧光染色结果受时间影响，新染的切片荧光强(见图1)，可有较高的准确性，但不利于后期回顾性研究。此时褪色后行抗酸染色效果依旧，镜检时仍旧有良好的着色效果和较高的敏感性及准确性(见图2)。

图1 金胺O染色法 结核抗酸杆菌呈亮绿色弯曲状

图2 抗酸染色法 结核抗酸杆菌呈紫红色弯曲状，呈散在分布

3 讨论

近年来，我国的结核病呈现上升趋势，现阶段，诊断结核分支杆菌感染过程中，金胺O荧光染色以其高敏感性，检出率高，镜检时间短等优点，已逐渐成为临床上最常用的检测方法[5]。在高敏感性的同时，金胺O荧光染色也存在假阳性，费用较高的弊端，不可代替传统的抗酸染色方法。而且，由于近年来抗生素使用不当，HIV感染或环境等多种因素影响，结核分枝杆菌可发生变异，因此，病理诊断过程中行HE染色常常得到不典型的组织形态。此时，在典型病变部位的石蜡组织切片中通过萋尼氏抗酸染色(Ziehl-Neelsen染色)找到结核分支杆菌对于诊断结核病具有重要的意义。本实验选取2017年9月至2018年9月之间疑似结核分枝杆菌感染的病人196例，经金胺O荧光染色后，由于染色时间长导致的荧光淬灭及人为的褪色操作，后在同一组织切片上行萋尼氏抗酸染色(Ziehl-Neelsen染色)，通过比较两种染色的敏感性及特异性，可知，两种染色方法的符合率极高。虽然金胺O荧光染色具有高敏感性的优点，但仍有假阳性的情况，可考虑与切片染色过程中的杂质有关[6]。此时，褪色后的金胺O荧光染色切片同样可获得高准确性的抗酸染色结果，并不会因切片的新旧情况而有不同染色结果，在不同的实验条件下仍然具有可行性，可重复验证结果的真实有效性。在疑似部位结核分枝杆菌存在范围小，多次制片将大大消耗待检组织的极端情况，常不易获得多个切片，可将经金胺O荧光染色的切片进行褪色处理已获得相同部位的抗酸染色结果。这对于验证少数金胺O荧光假阳性个例具有重要意义。萋尼氏抗酸染色(Ziehl-Neelsen染色)可在石蜡组织切片中找到形态各异的结核杆菌，具有高特异性，这才是诊断“金标准”。另外，抗酸染色具有保存时间长，成本低廉，操作环境简单的优点，适用于各级别医疗机构，使用范围广。

抗酸染色作为传统而又经典的手工染色，其过程中需注意许多细节。结核抗酸杆菌由于体内含脂质，蛋白质及多糖类物质，主要由于其脂质外壳使得染液无法进入，但能与苯酚和碱性复红结合成复合物，抵抗酸性物质的脱色从而着红色。这提醒我们，由于其不易上色和不易脱色的特点，染色结果具有不稳定性。在实践中，作者发现可改进部分操作提高其阳性率：(1)使用特殊透明剂。实验中，用松节油为主要材料的TO生物通明剂代替二甲苯进行脱蜡[7]。此步骤可保护菌体细胞壁完整性，提高其抗酸性，尤其对菌体较少的标本更具意义。(2)染色时间的合理控制[8]。一部分，注意分化时间，过长，易使得已着色的结核分枝杆菌掉色，易漏检；分化过短，紫红色背景过深，同样不易检出。另一部分，复染时间也要适宜，可加入亚甲蓝短暂染色数秒，若时间超过，也可将切片经流水冲洗，使其脱去部分蓝色。已达到良好的染色效果。(3)组织石蜡切片可适当偏厚，以5-6μm为宜，此步骤可使得切片内含较多的菌体，提高其阳性检出率，避免漏检[9]。