分散固相萃取-液相色谱-串联质谱法测定水基胶中的烷基酚聚氧乙烯醚

杨 飞，孟冬玲，邓惠敏，纪 元，贾 楠，王 颖，刘珊珊，范子彦，边照阳，唐纲岭*

1.国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区翠竹街6号 450001 2.广西中烟工业有限责任公司，南宁市西乡塘区北湖南路28号 530001 3.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

烷基酚聚氧乙烯醚（Alkylphenol ethoxylates，APnEO）广泛用作非离子表面活性剂、抗氧化剂、乳化剂、分散剂、消泡剂和农药助剂［1-2］。烷基酚聚氧乙烯醚及其降解产物具有较强的生态毒理效应以及生物累积性，通过食物链在动物和人体内积聚，影响哺乳类动物的生殖能力，被称为环境激素［3-6］。常用的APnEO有壬基酚聚氧乙烯醚（Nonylphenol ethoxylate，NPnEO）和辛基酚聚氧乙烯醚（Octylphenol ethoxylate，OPnEO），其平均乙氧基单元数（n）一般在2~16之间，其结构如图1所示。GB/T 20708—2019《纺织染整助剂产品中部分有害物质的限量及测定》规定壬基酚、辛基酚、壬基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚的质量分数之和应小于1 000 mg/kg［7］。水基胶是一种重要的烟用材料，受原料、工艺等生产条件的影响，水基胶中可能会有烷基酚聚氧乙烯醚。为保障烟用水基胶的安全，要求定期对烟用水基胶进行质量抽检。目前，烷基酚聚氧乙烯醚的分析方法主要有GC法［8］、GC-MS法［9］、凝胶色谱法［10］、HPLC法［11］及LC-MS法［12-15］等，主要涉及纺织品、土壤、水、农药制剂等样品。而对于烟用材料中烷基酚聚氧乙烯醚分析的报道很少，仅见张洪非等［16］采用高效液相色谱分析水基胶中的烷基酚聚氧乙烯醚，由于高效液相色谱法选择性差，经常导致假阳性结果出现。气相色谱法可以直接测定聚合度较低的APnEO，但是高聚合度的APnEO需要衍生化后才可以测定。目前，液相色谱-质谱法是最广泛、最成熟的方法。

图1 辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚的结构式Fig.1 Chemical structures of octylphenol ethoxylate and nonylphenol ethoxylate

选择高效提取、净化的技术是实现痕量残留物有效提取与准确定量的前提。水基胶样品常见的净化方式有液液萃取［17-18］和固相萃取［19］。但这些方法存在溶剂量消耗大、耗时较长、对环境不友好等缺点。分散固相萃取是将适量的净化剂直接作用于提取液中，尽可能多地吸附杂质同时保留目标化合物。与固相萃取相比，分散固相萃取少了淋洗、洗脱等步骤，相对更为快速和简便。为此，建立了以甲醇超声提取、C18分散固相萃取净化、液相色谱-串联质谱检测水基胶中烷基酚聚氧乙烯醚的方法，旨在为水基胶中烷基酚聚氧乙烯醚的测定提供方法参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

所有水基胶样品（1#~10#）全部由水基胶生产商主动提供，其中，1#、2#和3#为接嘴胶，4#、5#和6#为搭口胶，7#和8#为中线胶，9#和10#为包装胶。所有样品储存于棕色玻璃瓶中，于4℃下保存。

OPnEO标准品、NPnEO标准品（>98%，平均聚合度n=9），N-丙基乙二胺（PSA）、C18吸附剂、石墨化炭黑吸附剂（AR，上海安谱实验科技股份有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，韩国Duksan公司）；液氮（>99.99%，郑州源正特种气体有限公司）；醋酸铵（AR，北京百灵威科技有限公司）；超纯水（自制，电阻率≥18.2 MΩ·cm）。

API 4000四极杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源（ESI）（美国应用生物系统公司）；1200系列高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Inspire HILIC色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 mm，北京迪科马科技有限公司）；AEl63电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler Toledo公司）；KQ5200 DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；5810-R高速离心机（美国Eppendorf公司）；VX200涡旋振荡仪（美国Labnet公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；0.22μm有机相滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准工作溶液的配制

分别称取10 mg OPnEO标准品和NPnEO标准品于同一个10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到OPnEO和NPnEO的浓度均为1.0 mg/mL的一级混合标准储备液。移取100μL上述一级混合标准储备液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到OPnEO和NPnEO浓度均为10.0μg/mL的二级混合标准储备液。分别移取上述二级混合标准储备液2 000、1 000、500、200、100和50μL至6个10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得不同浓度的标准工作溶液。各标准工作溶液中OPnEO和NPnEO的浓度分别为2.00、1.00、0.50、0.20、0.10和0.05 μg/mL。所有溶液避光储存在－20℃的冰箱中。

1.2.2 样品前处理及分析条件

称取0.3 g水基胶样品于玻璃三角瓶中，加入5 mL超纯水，涡旋振荡，使样品分散在水中；向三角瓶中加入20 mL甲醇，超声提取20 min；以10 000 r/min的速率离心5 min，上清液待净化。取1.5 mL待净化液至2 mL的离心管中（内含25 mg C18吸附剂）涡旋5 min，然后以10 000 r/min的速率离心5 min，将上清液过有机相滤膜，取500μL滤液，用500μL甲醇稀释后进行LC-MS/MS分析。分析条件：

色谱柱：Inspire HILIC柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；色谱柱柱温：30℃；进样量：5μL；流动相流速：0.6 mL/min；流动相：A为5 mmol/L醋酸铵溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序：0~5.00 minVA∶VB=8∶92，5.00~17.00 minVA∶VB=8∶92~16∶84；17.00~22.00 minVA∶VB=16∶84；22.00~22.01 minVA∶VB=16∶84~8∶92；22.01~25.00 minVA∶VB=8∶92。离子源：电喷雾离子源（ESI）；雾化气压力：0.414 MPa；气帘气压力：0.069 MPa；辅助加热气压力：0.414 MPa；碰撞气压力：0.069 MPa；4种气体均为氮气；停留时间：50 ms；电离电压：5 500 V；离子化温度：500℃；正离子MRM模式采集。其他质谱参数见表1。

表1 （续）

表1 辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚的质谱参数Tab.1 MS parameters for octylphenol ethoxylate and nonylphenol ethoxylate

1.2.3 加标样品制备

空白加标样品的制备参考本研究组之前的方法［20］，得到3个不同浓度的空白加标样品，其中OPnEO和NPnEO的质量分数分别为10、50、100 mg/kg。加标样品按照上述前处理方法处理，每个加标水平重复测定5次。

1.2.4 数据分析

采用Origin8.5版软件计算平均值、回收率和相对标准偏差；采用美国应用生物系统公司的Analyst Software软件采集数据。通过加和OPnEO或NPnEO所有离子的峰面积对OPnEO或NPnEO进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

2.1.1 质谱条件

分别通过蠕动泵注入10μg/mL OPnEO和NPnEO标准溶液，在ESI+和ESI-模式下进行全扫描，通过对比发现ESI+模式下有较高的响应值和对称的峰形。由于液相系统中存在H+、NH4+和Na+，因此在正离子模式下APnEO容易形成［M+Na］+、［M+NH4］+和［M+H］+的母离子。在流动相中添加醋酸铵的情况下，OPnEO和NPnEO在正离子模式下主要以［M+NH4］+离子形式存在，且响应较强。相邻聚合度的OPnEO和NPnEO间隔1个乙氧基，相对分子质量相差44。OPnEO分子离子主要分布为m/z=（224+44n）（n=2~16），NPnEO分子离子主要分布为m/z=（238+44n）（n=2~16）。由图2可以看出，不同聚合度的OPnEO和NPnEO呈正态分布，OPnEO的分子离子中最强m/z为620.7，NPnEO的分子离子中最强m/z为634.8，对应于乙氧基链的长度均为n=9。在多反应监测（MRM）正离子模式下优化各种质谱参数的结果见表1。OPnEO和NPnEO的质谱图分别见图2a和图2b。

图2 辛基酚聚氧乙烯醚（a）和壬基酚聚氧乙烯醚（b）的全扫描质谱图Fig.2 Full scan mass spectra of octylphenol ethoxylate（a）and nonylphenol ethoxylate（b）

2.1.2 流动相的选择

本研究中采用的HILIC柱是亲水色谱柱，是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。由于HILIC柱采用强极性固定相，因此在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力为四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水，流动相中水是最强的洗脱溶剂。所以，在HILIC分离模式中一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%~40%，以保证其显著的亲水作用［21］。本研究中考察了甲醇-水和乙腈-水体系对烷基酚聚氧乙烯醚的分离影响，结果如图3和图4所示。由于在HILIC分离模式中甲醇和水的洗脱能力较强，因此在甲醇-水体系中APnEO的保留能力很差。因此，选择乙腈-水体系作为流动相。

图3 甲醇-水体系下辛基酚聚氧乙烯醚（a）和壬基酚聚氧乙烯醚（b）的HPLC-MS/MS色谱图Fig.3 HPLC-MS/MS chromatograms of octylphenol ethoxylate（a）and nonylphenol ethoxylate（b）using methanol-water as mobile phase

图4 乙腈-水体系下辛基酚聚氧乙烯醚（a）和壬基酚聚氧乙烯醚（b）的HPLC-MS/MS色谱图Fig.4 HPLC-MS/MS chromatograms of octylphenol ethoxylate（a）and nonylphenol ethoxylate（b）using acetonitrile-water as mobile phase

同时，流动相的pH会影响化合物的存在形式，从而影响其在色谱柱中的保留能力。分别考察了纯水（图5a）、0.1%（体积分数）甲酸水溶液（图5b）、5 mmol/L醋酸铵溶液（图5c）对APnEO分离的影响。有机相均采用乙腈作为流动相，以OP5EO和NP5EO为例，通过比较发现，在5 mmol/L醋酸铵溶液条件下化合物的响应最高。继续增大醋酸铵的浓度，化合物的响应没有明显的增加；且缓冲盐的浓度若太高，容易在喷针处沉积，从而堵塞喷针。因此，选择5 mmol/L醋酸铵溶液和乙腈作为流动相。

图5 不同pH条件下OP5EO和NP5EO的HPLC-MS/MS色谱图Fig.5 HPLC-MS/MS chromatograms of OP5EO and NP5EO under different pH conditions

2.1.3 净化材料的选择

由于基质干扰，提取液不经净化直接注入仪器会导致灵敏度降低，同时造成仪器污染，因此有必要对样品进行净化。以空白接嘴胶为例，在空白样品中加入适量的OPnEO和NPnEO标准溶液，制备得到3个不同浓度（10、50、100 mg/kg）的空白加标样品。考察了C18、PSA、石墨化炭黑3种分散固相萃取材料对净化效果和回收率的影响。结果（表2）显示：石墨化炭黑对OPnEO和NPnEO有不同程度的吸附，因此回收率较低；C18分散固相萃取材料的净化效果最好，可以获得较为满意的回收率。因此，在后续实验中采用C18分散固相萃取材料对萃取液进行净化。

表2 净化材料对烷基酚聚氧乙烯醚回收率的影响Tab.2 Effects of purification materials on recoveries of alkylphenol ethoxylates （%）

2.2 方法评价

2.2.1 线性方程、检出限和定量限

在优化的色谱条件下，对配制好的系列不同浓度的混合标准工作溶液进行测定，以不同聚合度的APnEO定量离子的峰面积之和对其质量浓度绘制标准工作曲线。标准工作曲线的形式为Y=AX+B，其中A和B分别表示为斜率和截距。线性方程和相关系数见表3，结果表明，在0.05~2.00 μg/mL浓度范围内，APnEO的质量浓度和定量离子的峰面积之和具有良好的线性关系（R2≥0.998 7）。将加标空白水基胶萃取溶液中产生的信噪比（S/N）等于3和10时的浓度分别定义为检出限（LOD）和定量限（LOQ），OPnEO和NPnEO的LOD分别为6.64和7.42μg/kg，LOQ分别为22.6和24.9μg/kg。

表3 烷基酚聚氧乙烯醚的线性方程、检出限和定量限Tab.3 Linear equations,LODs and LOQs for alkylphenol ethoxylates

2.2.2 方法的回收率和精密度

采用空白样品加标回收实验测试方法的回收率和精密度，该方法的精密度由重复性实验确定，并以RSD表示。空白样品是经过上述方法测定后不含有OPnEO和NPnEO的水基胶。制备3个不同质量分数（10、50、100 mg/kg）的空白加标样品，按照上述方法对加标样品进行处理，每个浓度的样品重复测定5次。结果（表4）显示，在所有浓度水平下各种水基胶的回收率（79.8%~93.8%）均较令人满意，相对标准偏差（RSD）为2.9%~6.6%。

表4 不同加标水平时方法的回收率和精密度Tab.4 Recoveries and precisions of the proposed method at different spiked levels （%）

2.2.3 方法对比

本研究中采用新建立的HPLC-MS/MS法和HPLC［16］法对3个不同添加浓度的接嘴胶样品进行了对比分析，每个样品重复测试5次，结果如表5所示。可知，两个方法之间的相对平均偏差在1.3%~3.1%之间，说明不同方法之间一致性较好。OPnEO和NPnEO的HPLC色谱图如图6所示，HPLC-MS/MS总离子色谱图如图4所示。

表5 本方法与HPLC法检测结果的对比Tab.5 Comparison of detection results between the developed method and HPLC method

2.2.4 实际样品检测

采用本方法和HPLC法［16］检测了10个不同类型的水基胶样品。结果（表6）显示：采用HPLC法在1个接嘴胶（1#）和2个搭口胶（4#、6#）样品中检测出NPnEO，而采用本方法仅在2个搭口胶样品（4#、6#）中检出NPnEO，且检测值与HPLC方法一致性较好。经分析，1#样品采用HPLC法检出NPnEO是由假阳性造成的。NPnEO是由聚合度为2~16的壬基酚聚氧乙烯醚组成的混合物，在HPLC法中，不同聚合度的NPnEO的色谱保留时间差异很小，色谱峰重叠成一个宽峰，容易与共流出物重叠，造成假阳性（图6）。HPLC-MS/MS在MRM扫描模式下对不同聚合度的APnEO进行监测，选择离子色谱峰峰形良好，具有很好的选择性和特异性，可以避免假阳性结果的产生。

图6 辛基酚聚氧乙烯醚和壬基酚聚氧乙烯醚的HPLC色谱图Fig.6 HPLC chromatograms of octylphenol ethoxylate and nonylphenol ethoxylate

表6 实际水基胶样品的测定结果①Tab.6 Test results of actual water-based adhesive samples

3 结论

①建立了分散固相萃取净化结合液相色谱-串联质谱检测水基胶中烷基酚聚氧乙烯醚的分析方法，该方法以C18为分散固相萃取剂，亲水Inspire HILIC色谱柱为分析柱。②在最优化的条件下，不同聚合度的壬基酚聚氧乙烯醚和辛基酚聚氧乙烯醚可在25 min内实现基线分离。不同质量分数下，所有分析物的回收率在79.8%~93.8%之间，相对标准偏差为2.9%~6.6%。③该方法前处理简便、高效，灵敏度高，结果稳定可靠，可满足实验室中大批量水基胶样品的准确、快速测定。