降香黄檀生根的生理机制

徐珊珊，徐大平，洪 舟，刘小金，杨曾奖，李毓琦，薛世玉，郭俊誉

（1.中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州 510520；2.南京林业大学，江苏 南京 210037）

降香黄檀Dalbegia odorifera是豆科Leguminosae黄檀属Dalbergia的半落叶乔木，是我国最珍贵的热带树种，国家Ⅱ级保护植物。降香黄檀生长旺盛、枝叶发达，具有一定的固碳释氧和降温增湿能力[1]；根部具有固氮菌，能改良土壤[2]；对石漠化环境具有很强的适应性，是优良的喀斯特石漠化地区造林树种，具有很大的生态效益[3]。降香黄檀根部心材供药用部分名降香，具有一定的药用价值，可用于治疗高血压、冠心病和心绞痛等疾病[4]。降香黄檀的木材优质且名贵，以其木材为原料制作的精美家具、工艺品和艺术品具有极高的经济价值，是非常珍贵的消费品和收藏品。近些年来，随着经济的不断发展，降香黄檀木材需求量越来越多，而现有商品材几乎都来源于野生资源，过度的采伐已经使野生资源急剧减少，木材供应严重不足，因此迫切需要进行人工栽培。

自20世纪50年代以来，降香黄檀已在广东、广西、福建等多地引种成功，并可进行大面积造林，生长良好[5-6]。种质资源调查研究发现降香黄檀中存在丰富的遗传变异，为遗传改良提供了丰富的材料[7]。目前对降香黄檀的研究主要集中在引种栽培、心材形成、组织培养和高效培育等方面，鲜有关于其扦插繁殖研究的报道。扦插繁殖是保存林木优良遗传性状（珍贵树种、抗逆类基因）的重要手段[8]，因此，开展降香黄檀扦插繁殖试验，通过研究降香黄檀不定根形成过程中的内源物质的变化过程，探讨其无性繁殖生根机理，是解决降香黄檀扦插繁殖成功的关键所在，为形成完善实用的培育技术体系，保持母本的优良性状，探讨多种繁殖方法，保证优质种苗供应等提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验插穗采自中国林业科学研究院热带林业研究所（以下简称“热林所”）苗圃，位于广东省广州市，113°23′E，23°11′N。选取生长健壮、无病虫害的1年生降香黄檀实生苗剪成长度为16 cm左右、带有3～4 个饱满芽的不带叶插穗，插穗上端平切，切口距离第1 轮芽0.5 cm 以上，下端斜切，切口于腋芽背面下方1 cm 处。

1.2 试验方法

试验于2019年10月17日—12月5日在热林所温室进行。扦插容器选用32 孔黑色穴盘（规格：60 mm×60 mm×115 mm），扦插基质选用V（黄心土）∶V（泥炭土）=1∶1 的混合基质。扦插前3 d，用5 g·L-1的高猛酸钾溶液对基质进行消毒，覆盖塑料薄膜，扦插前1 d 打开塑料薄膜。插穗采集后先用1 g·L-1的多菌灵溶液浸泡下端10 min 进行消毒，然后用清水冲洗干净，最后用500 mg·L-1的ABT1 生根粉浸泡10 min，采用引洞法进行扦插。为了防止插穗脱水死亡而影响成活率，最好边采边插，插穗要保持湿润。扦插后，覆盖塑料薄膜和遮阴网，每7～10 d 交替使用1 g·L-1的多菌灵溶液和3 g·L-1的高锰酸钾溶液进行消毒。本试验进行4 次重复，每重复扦插64 个插穗。

1.3 调查指标、测定方法及数据处理

扦插48 d 后统计生根率、不定根数量、不定根长、不定根粗、根生物量、新梢数、叶生物量。扦插后每隔6 d 取样1 次（取样时间分别为0、6、12、18 d），共取样4 次，每个重复随机抽取3 根插穗（插穗明显死亡的不取样），将插穗清洗干净后，剥取插穗基部3 cm 部分，剪碎混匀后放入离心管中，液氮处理后放入-80℃的超低温冰箱中备用。采用蒽酮比色法测定可溶性糖和淀粉含量，采用酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定可溶性蛋白含量[9]、植物激素（IAA、GA3、ABA、ZR、CTKs）含量[10]、相关酶（IAAO、PPO、SOD、POD）活性[11]。

试验数据用Excel 2016 软件进行分析并作图，采用SPSS 23.0 软件进行方差分析和Duncan 多重比较。

2 结果与分析

2.1 降香黄檀扦插生根统计

1年生降香黄檀扦插48 d 后，根系指标如表1所示。根据对降香黄檀扦插生根过程的外部形态观察发现，扦插后0～6 d 为降香黄檀的愈伤组织高发期，在此时期内愈伤组织基本形成，部分插穗芽部开始萌生；6～12 d 为不定根诱导期，此时期内插穗皮层发生了一系列的分子和生理生化变化，插穗开始展叶；12～18 d 是不定根的生长发育期，此时期伴随着细胞分裂、根原基的形成和不定根的伸长，插穗的叶子也逐渐长大。

表1 降香黄檀扦插生根统计结果Table 1 Statistical results of cutting rooting of D.odorifera

2.2 降香黄檀扦插生根过程中营养物质含量动态变化特征

2.2.1 碳水化合物含量

插穗生根的过程必然要消耗一定的营养物质，可溶性糖和淀粉是这一过程的主要营养物质来源[8]。降香黄檀在扦插生根过程中可溶性糖和淀粉含量均呈“下降—上升—下降”趋势，拐点均出现在扦插后第6 天和第12 天（图1）。扦插初期，插穗处于逆境伤害中，新陈代谢速度加快，蒸腾作用较强，愈伤组织的形成和芽的萌生消耗了大量的可溶性糖导致其含量急剧下降；此时淀粉逐渐水解以补充可溶性糖含量，用于插穗的生命活动，从而导致其含量缓慢下降。扦插6 d 后，插穗逐渐适应逆境条件，愈伤组织和芽基本形成，导致可溶性糖含量短暂回升，为不定根的生长积累营养；此时期不再需要淀粉水解来补充可溶性糖含量导致淀粉含量逐渐上升。不定根生长期，插穗呼吸作用逐渐增强，大量不定根的伸长生长需要消耗能量，导致可溶性糖和淀粉含量再次下降。可溶性糖和淀粉含量最低值均出现在扦插第18 天，分别为161.65 μg·g-1和4.90 mg·g-1，且低于扦插前，表明扦插生根过程必定消耗了一定量的可溶性糖和淀粉来提供能量。方差分析表明，扦插第0 天与第6 天可溶性糖含量差异极显著（P＜0.01），不定根形成后（18 d）与未扦插时（0 d）插穗内可溶性糖含量差异极显著（P＜0.01）；不同扦插时期淀粉含量差异不显著（P＞0.05）。

图1 降香黄檀扦插生根过程中可溶性糖和淀粉含量变化特征Fig.1 Change characteristics of soluble sugar and starch content during adventitious root formation of D.odorifera

2.2.2 可溶性蛋白含量

可溶性蛋白含量在降香黄檀扦插生根过程中呈一直下降的趋势（图2），不定根形成后（18 d）的可溶性蛋白含量比扦插前（0 d）下降了25%，表明降香黄檀插穗消耗了大量的可溶性蛋白来促进新细胞的形成和根系生长。扦插前期和后期下降速率高于扦插中期，表明为愈伤组织的形成和不定根生长提供能量的可溶性蛋白含量和酶类物质消耗较快，而产生的可溶性蛋白较少。方差分析表明，扦插第0 天（4.71 mg·g-1）与第12 天（3.96 mg·g-1）和第18 天（3.54 mg·g-1）插穗内可溶性蛋白含量差异极显著（P＜0.01）。

图2 降香黄檀扦插生根过程中可溶性蛋白变化特征Fig.2 Change characteristics of soluble protein content during adventitious root formation of D.odorifera

2.3 降香黄檀扦插生根过程中植物激素含量动态变化特征

2.3.1 生长素

IAA 含量在降香黄檀扦插生根过程中呈一直下降的趋势（图3），且下降速率逐渐变缓。扦插初期，IAA 含量下降较快，可能是插穗处于切割逆境伤害中，新陈代谢速度加快，同时也说明愈伤组织的形成会消耗大量的IAA。不定根形成后（18 d）的IAA 含量比扦插前（0 d）下降了17.68%，表明较低浓度的IAA 有利于不定根的伸长生长。方差分析表明，扦插第0 天与第12 天和第18 天的IAA 含量差异极显著（P＜0.01），扦插第6 天与其它阶段的IAA 含量差异不显著（P＞0.05）。

图3 降香黄檀扦插生根过程中IAA 含量变化特征Fig.3 Change characteristics of IAA content during adventitious root formation of D.odorifera

2.3.2 细胞分裂素

在降香黄檀扦插生根过程中CTKs 与ZR 含量均呈“下降—上升—下降”的趋势（图4）。扦插前期，愈伤组织的增殖消耗了一定的CTKs 和ZR；扦插中期，CTKs 和ZR 逐渐积累，为后期不定根的伸长做好准备；扦插后期，不定根的形成消耗了大量的CTKs 和ZR，导致第18 天的CTKs含量不显著低于第0 天，第18 天的ZR 含量极显著低于第0 天。方差分析结果表明，扦插第6 天与第12 天、第18 天的CTKs 含量差异极显著（P＜0.01）；扦插第18 天与第6 天和第12 天的ZR 含量差异达到极显著水平（P＜0.01）。

图4 降香黄檀扦插生根过程中细胞分裂素含量变化特征Fig.4 Change characteristics of cytokinin content during adventitious root formation of D.odorifera

2.3.3 赤霉素

在降香黄檀扦插生根过程中GA3含量呈先下降后上升的单峰变化趋势（图5）。0～6 d，插穗开始形成愈伤组织，GA3含量缓慢下降；6～12 d，插穗开始诱导不定根的形成，GA3含量急速下降到谷底，GA3最低值为3.74 ng·g-1；12～18 d；进入插穗不定根伸长生长期，GA3含量缓慢回升，此时GA3水平的提高有利于不定根皮层细胞的分裂和伸长速度。总体来看，扦插第18 d 比0 d 下降了21.80%。方差分析结果表明，0 d 与12 d 和18 d，6 d 与12 d 和18 d 插穗内的GA3含量差异达到极显著水平（P＜0.01）。

图5 降香黄檀扦插生根过程中GA3 含量变化特征Fig.5 Change characteristics of GA3 content during adventitious root formation of D.odorifera

2.3.4 脱落酸

在降香黄檀扦插生根过程中ABA 含量的变化如图6所示。愈伤组织形成期下降，不定根诱导期上升，不定根生长期下降。在愈伤组织形成期和不定根生长期分别下降了13.64%和15.64%。扦插第18 天比扦插第0 天下降了15.32%。方差分析结果表明，扦插第0 天和第18 天的ABA 含量差异显著（P＜0.05）。

图6 降香黄檀扦插生根过程中ABA 变化特征Fig.6 Change characteristics of ABA content during adventitious root formation of D.odorifera

2.3.5 激素比值

对大多数植物来说，IAA、ZR 能促进扦插生根，ABA 则抑制扦插生根，因此IAA/ABA 和ZR/ABA 值对于不定根的形成具有很大的影响。降香黄檀插穗内IAA/ABA、ZR/ABA 在扦插后0～6 d逐渐升高，并达到峰值；在6～12 d 逐渐降低，并在12 d 时达到谷值；在12～18 d 逐渐回升。ZR/IAA 值在扦插后0～6 d 缓慢上升，在6～12 d 继续上升并达到峰值，在12～18 d 逐渐降低。GA3/IAA 值则一直处于较为平缓的状态。

2.4 降香黄檀扦插生根过程中酶活性动态变化特征

图7 降香黄檀扦插生根过程中植物激素比值变化Fig.7 Changes of the ratio of endogenous hormone during adventitious root formation of D.odorifera

在降香黄檀扦插生根过程中，SOD、PPO 和POD 活性呈一直下降的变化趋势（图8A—C）。其中，SOD 活性在扦插前期和后期下降速度缓慢，扦插中期下降速度较快；而PPO 和POD 活性变化速度正相反，PPO 和POD 活性在前期和后期下降速度较快，在中期下降缓慢。方差分析表明，扦插第6 天与第18 天的SOD、PPO 和POD 活性差异均达到极显著水平（P＜0.01），且SOD 不定根形成后（18 d）比扦插前（0 d）下降了15%，PPO 下降了20%，POD 下降了23%。IAAO 活性在降香黄檀插穗生根过程中表现出先降低后升高的单峰变化趋势（图8D）。扦插0～6 d 内，IAAO 活性迅速下降，并在扦插第6 d 达到谷值（1.93 IU·g-1）；扦插6～12 d 时处于降香黄檀不定根诱导期，此时愈伤组织逐渐形成，不定根开始形成，IAAO 活性缓慢上升；扦插后12～18 d，不定根逐渐伸长，IAAO 活性快速上升，并在扦插第18 d 达到最高值（2.19 IU·g-1）。方差分析结果表明，扦插不同阶段的IAAO 活性差异不显著（P＞0.05）。

图8 降香黄檀扦插生根过程中酶活性变化特征Fig.8 Change characteristics of enzyme activities during adventitious root formation of D.odorifera

3 结论与讨论

3.1 营养物质与插穗生根的关系

可溶性糖既可作为渗透调节物质和防脱水剂，也可作抗氧化剂，起到保护插穗的作用[12]。淀粉可以在淀粉酶和GA3的作用下水解为可溶性糖，以补充消耗掉的可溶性糖。可溶性蛋白不仅是生根的营养物质，还是调节代谢的某些酶类物质，具有增强插穗抗逆性的作用。本试验中可溶性糖和淀粉均呈“下降—上升—下降”的趋势，而可溶性蛋白呈一直下降的趋势，说明降香黄檀扦插生根过程需要消耗大量营养物质支持愈伤组织的形成、不定根的诱导、形成和伸长生长。本试验对可溶性蛋白含量的研究结果与杜伟等[13]对桑树MorusL.、曾炳山等[14]对柚木Tectona grandis、王小玲等[15]对四倍体刺槐TetraploidRobinia pseudoacacia的研究一致。综上所述，可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量的变化与插穗不定根的形成过程密切相关。今后扦插时，在愈伤组织形成期和不定根生长期适当添加外源营养物质可能会提高生根率。

3.2 植物激素与插穗生根的关系

IAA是影响插穗不定根形成的主要植物激素，主要通过促进形成层的分生组织细胞、韧皮射线细胞和皮层薄壁细胞的分裂和分化，从而促进促愈伤组织和不定根的形成[16-17]。有些研究认为较高浓度的IAA 有利于不定根的诱导和生长[18]，但也有研究认为IAA 含量的变化与林木生根能力的差异并没有显著的关系[19]，而是IAA 的代谢在不定根形成过程中起到重要作用[20]。此次研究结果更加印证了以往的研究结论，即IAA 含量的变化对不定根的形成起到了较为直接的调节作用[17]。本研究中，IAA 含量呈一直下降的趋势，这与以往许多研究结果不一致，如美国流苏Chionanthus virginicus插穗IAA 含量呈“上升—下降”趋势[21]，沙生柽柳Tamarix taklamakanensis呈“上升—下降—上升”趋势[22]，而国槐Sophora japonica则呈“下降—上升—下降”趋势[23]。造成这种差异的原因可能是不同林木插穗内不同浓度的IAA 在扦插进程中起到的作用不尽相同[23]。总体来看，较低含量的IAA 有助于降香黄檀愈伤组织和不定根的形成与生长发育。

扦插生根过程中插穗内的CTKs 对不同种林木的作用具有多面性。一方面，CTKs 主要通过促进维管形成层细胞的分裂和增殖，从而促进愈伤组织和不定根的形成以及侧芽的生长和分化[24]；另一方面，CTKs 对一些林木插穗不定根的形成起到抑制作用[17,25]，还有一些研究认为CTKs 对林木扦插生根的影响并不大[19]。ZR 是CTKs 的一种，适宜浓度的ZR 能够促进愈伤组织的形成、根原基的分化和不定根的伸长生长[26]。本研究中ZR 含量的变化与CTKs 变化规律相似，均呈“下降—上升—下降”的趋势，这与王艳晶等[23]、俞良亮等[27]、吴文浩等[28]、韩继红等[29]对插穗内ZR 含量变化的研究结果基本一致。因此ZR 与CTKs 对降香黄檀扦插生根的作用相似，即CTKs 和ZR 含量的降低有利于愈伤组织的形成和不定根的生长，而CTKs 和ZR 含量的升高则有利于不定根的诱导。这与李永欣等[30]得出的较低的ZR 含量促进根原基的分化，较高的ZR 含量有利于根原基的生长的结论相反，究其原因可能是树种不同所致。

GA3的主要作用是改变根内皮层细胞分裂和生长的速度，促进淀粉水解，为插穗生根提供能量，从而调控茎的伸长和不定根的生长[31-32]。GA3对不同林木扦插生根的作用不尽相同。GA3对于毛白杨Populus tomentosa等林木扦插生根主要起到抑制作用[19]；而对于树牵牛Ipomoea fistulosa等林木则起到促进作用[33]。本实验中，GA3呈“下降—上升”趋势，表明低含量的GA3有利于降香黄檀插穗愈伤组织的形成和不定根的诱导；高含量的GA3有利于不定根的伸长生长。何崇单等[32]对北美香柏Thuja occidentals扦插过程中的GA3含量变化的研究结果与本试验一致。

对于大多数植物来说，ABA 抑制插穗的生根[34]，但也有一些研究表明低浓度的ABA 能促进生根[23]。本试验中，ABA 含量在愈伤组织形成期和不定根生长期逐渐降低，在不定根诱导期逐渐升高，且IAA/ABA 在愈伤组织形成期和不定根生长期逐渐升高，在不定根诱导期逐渐降低，表明较低水平的ABA 有助于降香黄檀愈伤组织的形成和不定根的伸长生长，ABA 含量的升高有利于降香黄檀不定根的诱导。本试验结果与赵爽等[35]对山木通Clematis finetiana、张往祥等[36]对金雀花Cytisus scoparius、何崇单等[32]对北美香柏扦插生根过程中ABA 含量变化趋势的研究一致。

插穗不定根形成的各个时期往往伴随着植物激素含量的剧烈变化，插穗内的IAA、CTKs、ZR、GA3和ABA 并不是单独起作用的，而是呈现此消彼长的协同作用共同调控不定根的形成和生长发育，因此用不同激素的比值来衡量插穗生根的难易程度非常有意义。本研究中，IAA/ABA、ZR/ABA 值在降香黄檀愈伤组织形成期和不定根形成期均呈上升趋势，并在扦插后第6天达到峰值，表明IAA、ZR 含量的上升和ABA 含量的下降协同作用，促进了愈伤组织的形成和分化以及不定根的生长发育；IAA/ABA、ZR/ABA 值在不定根诱导期呈下降趋势，表明较低的IAA 和ZR 以及较高的ABA 含量有利于不定根的诱导形成。IAA/ABA、ZR/IAA、ZR/ABA 值均在不定根诱导期发生急剧变化，表明IAA、ZR、ABA 是诱导不定根产生的主要激素。GA3/IAA 值一直处于较为平稳状态，可能是由于ZR 和ABA 的调节作用大于GA3所致。由此可见，在降香黄檀扦插生根过程中，IAA、ZR、GA3和ABA 协同作用，达到一定的平衡状态，在这种状态下共同调控不定根的形成和成长发育。

3.3 酶活性与插穗生根的关系

林木扦插生根过程中SOD、PPO、POD、IAAO 活性密切相关。SOD 是插穗体内重要的保护酶，与POD 共同作用，构成了降香黄檀体内的酶促保护系统[37]。当插穗受到逆境伤害产生活性氧或过氧化物时，体内的酶促保护系统会及时作出反应，清除有害物质，保护细胞膜系统免受伤害[38-39]。本试验中SOD、POD 活性呈一直下降的趋势，表明SOD 和POD 在扦插开始后就起到保护作用。但是在扦插初期，SOD 活性下降较为缓慢，POD 活性下降较为迅速，表明插穗膜脂过氧化程度较低，对逆境伤害适应较快，降香黄檀插穗愈伤组织的形成需要消耗一定的SOD 和POD，POD 可能与木质素的形成、IAA 的代谢以及阻止病原体的入侵有关[40-41]。一些研究认为POD 活性一般呈单峰或双峰变化[39,42-43]，但本研究中POD活性呈现逐渐降低的趋势，可能与树种特性有关，也可能与采穗母树的年龄或采穗部位有关，这一点仍需进一步探索。

PPO 可以催化酚类物质与IAA 合成一种生根辅助因子“IAA-酚酸复合物”，通过调节IAA 的代谢，促进愈伤组织和不定根的形成。在降香黄檀整个扦插生根过程中，PPO 活性呈一直降低的变化趋势。在愈伤组织形成期，PPO 活性急速下降，此时期PPO 可以催化插穗基部的酚类物质合成生根辅助因子，有利于促进愈伤组织的形成；在不定根诱导期，PPO 活性下降非常缓慢，表明此时期PPO 活性对插穗不定根的诱导影响较小；在不定根形成期，不定根逐渐形成，酚类物质逐渐被分解，因而PPO 活性逐渐降低，这有利于IAA 的积累，从而加快细胞分裂和分化，促进不定根的生长。

IAAO 能够氧化插穗内过多的IAA，从而调节IAA 水平，影响不定根的形成[44]。本研究中，愈伤组织形成期的IAAO 活性逐渐降低，氧化IAA 的速度逐渐降低，结合IAA 含量的变化，表明较高浓度的IAA 有利于愈伤组织的形成；扦插中期和后期，IAAO 活性逐渐升高，会氧化较多的IAA，导致IAA 含量降低，表明低浓度的IAA有利于不定根的形成和伸长生长。这与姚锐等[41]和Nag 等[45]的研究结果一致。但也有一些研究表明，在不定根表达阶段，较低的IAAO 活性能够氧化少量的IAA，从而有助于不定根的形成。因此IAAO 对不定根的影因林木种类而异，IAAO 对不定根的作用仍有待于进一步研究。

不定根形成的难易程度决定着林木扦插繁殖的难易程度。不定根形成由外部环境因子（生长调节剂、采穗母树年龄、采穗部位、插穗规格和后期管理等）和内部物质变化（营养物质、植物激素、酶活性和生根抑制物质）共同决定。本试验通过对降香黄檀插穗生根进程中不同时期的营养物质、植物激素和酶活性变化过程进行动态分析，从而发现影响扦插生根的生理物质并不是单一的，而是多种物质相互促进或制约共同调控着愈伤组织和不定根的产生。研究结果表明，降香黄檀在不同扦插时期的各种生理指标出现一定的规律性变化，这种变化能够反映了插穗在逆境条件下为存活而表现的应激反应。在外界环境基本处于一致的条件下，插穗体内的营养物质、植物激素和酶活性对插穗能否生出不定根起到关键的作用。除了本研究中的生理物质外，影响降香黄檀扦插生根的内部物质还有很多，其相互作用较为复杂。因此，对于降香黄檀的生根机理研究仍需大量的实践探索。