气相色谱-串联质谱法测定豆乳中12 种有机磷及氨基甲酸酯类农药残留

谢瑞龙，梁建英

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂因具有广谱、高效、廉价等优点，已被广泛用于农业生产的虫害防治过程中。但由于这些农药的不合理使用，不但对生态环境造成破环，药物残留还直接威胁到人类的身体健康[1-2]。 根据作用机制，这2 类农药会抑制动物或人体内乙酰胆碱酯酶的活性，造成乙酰胆碱不断累积，影响其正常传导，导致中毒现象的发生；若在人体内长期蓄积还会致畸、致癌、致突变，甚至死亡[3-5]。

豆乳作为植物乳的一种，因其含有丰富的营养成分，有助于调节内分泌、预防骨质疏松症、更年期综合征以及心血管疾病等，所以越来越受到消费者 喜爱[6-7]。目前，豆乳中有机磷及氨基甲酸酯类农药检测方法少有文献研究，而植物源性食品的检测方法有酶抑制法[8]、酶联免疫法[9]、气相色谱法[10-11]、液相色 谱法[12-13]、气相色谱-质谱法[14-15]、气相色谱-串联质谱（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS） 法[16-17]、液相色谱-串联质谱法[18-19]等。其中，GC-MS/MS法具有灵敏度高、特异性强、分离效果好等优点，是多种农药残留定量分析的主要手段。为了保障豆乳产品的质量安全，避免受到农药残留污染的风险，本研究利用QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）的前处理方法，通过优化关键步骤，建立一种GC-MS/MS同时测定豆乳中12 种常见有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的方法。这将为其他植物乳中农药残留检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆乳样品：植选浓香豆乳、植选植物乳、植选浓香豆乳（黑芝麻、黑豆） 内蒙古伊利实业集团股份有限公司。

无水硫酸镁（MgSO4）、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸二钠盐倍半水合物（柠檬酸氢二钠）、醋酸钠（均为分析纯） 美国安捷伦科技有限公司；乙酸乙酯（色谱纯）、乙腈（农残级）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、石墨化炭黑、含12 种农药（溴硫磷、三硫磷、毒虫畏、毒死蜱、甲基毒死蜱、蝇毒磷、甲基嘧啶磷、仲丁威、苯硫威、异丙威、抗蚜威、残杀威）的混标（100 μg/mL）、环氧七氯B（内标，1 mg/mL） 上海 安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TQS9000气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（配有电子轰击离子源） 美国Thermo Fisher Scientific公司；Biofuge Stratos低温高速离心机 德国Sigma公司；分析天平（感量0.000 1 g） 瑞士Mettler Toledo公司；TurboVap LV氮吹仪 瑞典Biotage公司；KS501涡旋振荡器 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

准确称取10.0 g豆乳样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋振荡1 min；然后在冷水浴条件下加入4.0 g MgSO4、1.0 g氯化钠、1.0 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠后，继续振荡5 min，4 ℃、4 200 r/min离心5 min；取7.0 mL上清液有机层至内含1 200 mg MgSO4、400 mg PSA和400 mg C18的15 mL离心管中，振荡5 min，4 ℃、4 200 r/min离心5 min；取4.0 mL上清液至氮吹管中，40 ℃氮吹至近干；加入20 μL 5 μg/mL内标溶液，乙酸乙酯复溶至1.0 mL，过滤后供GC-MS/MS测定分析。

1.3.2 标准工作溶液配制

采用空白基质加标的方式，称取不含待测农药的样品按上述操作制备样品空白提取液，空白基质溶液氮气吹干后，加入20 μL 5 μg/mL内标溶液，依次加入一定体积的混合标准品工作液，用乙酸乙酯稀释定容至1.0 mL，配制成质量浓度梯度为5、10、20、50、100、150、200 ng/mL的12 种化合物的混合标准工作溶液。现用现配。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：5%苯基-甲基聚硅氧烷石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃/min升温至90 ℃，并保持1.5 min，以25 ℃/min升温至180 ℃，以5 ℃/min升温至280 ℃，以10 ℃/min升温至300 ℃，保持5 min；进样量1 μL；进样方式：不分流进样。

1.3.4 质谱条件

电离方式：电子轰击源；电离能量70 eV；离子源温度300 ℃；传输线温度280 ℃；溶剂延迟6 min；监测方式：选择反应监测模式，12 种农药及环氧七氯B的保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞电压参见表1。

1.3.5 结果计算

12 种农药的含量计算公式如下。

式中：X为试样中被测组分残留量/（mg/kg）；ρ为由标准工作曲线得到的被测组分质量浓度/（ng/mL）；V为样品溶液定容体积/mL；m为试样质量/g；n为稀释倍数；1 000为换算系数。

1.4 数据处理

使用Tracefinder 4.1软件处理标准工作曲线，得到被测组分质量浓度；使用WPS Office 2020软件绘制簇状柱形图。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的确定

为了选择合理的前处理方法，本研究参照植物源性食品基质，对GC法和GC-MS法测定有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的国内标准进行总结。由表2可知，总体而言，前处理方法可分为液-液萃取、固相萃取柱及分散固相萃取3 种方式。其中，GB/T 5009.145—2003《植物性食品中有机磷和氨基甲酸酯类农药多种残留的测定》[11]的前处理步骤采用丙酮水溶液提取，二氯甲烷二次提取，硅胶柱净化，最后浓缩定容。该方法的实验步骤复杂，且需要消耗大量有机试剂，对环境及人员危害较大。NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定》[20]为多个方法的合集，对于有机磷类农药，采用液-液萃取，乙腈提取，过滤浓缩后定容；对于氨基甲酸酯农药，采用乙腈提取，经氨基柱净化，氮吹复溶上样。该方法操作较麻烦，需要在80 ℃水浴条件下加热浓缩，且样品净化不够充分，不适用于复杂的样品基质，不利于仪器长时间使用。对于DB34/T 1076—2009《蔬菜、水果、粮食、茶叶中40 种有机磷和氨基甲酸酯类农药多残留同时测定方法 气相色谱法》[21]和GB 23200.8—2016《食品安全国家标准 水果和蔬菜中500 种农药及相关化学品残留量的测定 气相色谱-质谱法》[22]，前处理有了明显改进，采用乙腈提取-固相萃取柱净化的前处理方法，溶剂的使用量及操作步骤部分减少。GB 23200.113—2018《食品安全国家标准 植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》[16]中除提供了乙腈提取-石墨化炭黑/氨基复合柱净化的方法外，还推荐了QuEChERS前处理方法。研究表明，QuEChERS整个过程操作简单、试剂用量少、环境污染小、处理时间短[23]。综上所示，结合实际实验操作，本研究最终确定采用QuEChERS前处理法。

2.2 萃取步骤中降温方式的选择

QuEChERS法提取时会加入MgSO4，可以更好地促使水相与有机相分层。然而MgSO4遇水会放出大量的热，容易导致部分农药分解，最终影响目标物的提取效率。为了避免这一问题的发生，本研究采用水传导散热的原理，快速释放MgSO4遇水产生的热量，降低实验体系的温度。优化后的实验流程为在冷水浴条件下向离心管中加入盐包。

将冷水浴降温与传统方式（常温实验环境）降温进行对比实验，每组做3 次平行。由图1可知，2 种降温方式的平均加标回收率分别为82.3%～97.6%和67.0%～85.8%；在冷水浴条件下，所有目标物的平均加标回收率优于传统方式处理，其中异丙威效果最明显，其平均加标回收率提升15.3%。因此，本研究选择在冷水浴条件下进行实验。

图1 2 种降温方式对12 种农药平均加标回收率的影响 （加标量0.004 mg/kg）Fig. 1 Effect of two cooling methods on average recoveries of 12 pesticides at spiked concentration of 0.004 mg/kg

2.3 净化步骤中净化包的选择

为了确定合适的QuEChERS净化包，结合国标 GB 23200.113—2018《食品安全国家标准 植物源性食品中208 种农药及其代谢物残留量的测定 气相色谱-质谱联用法》中蔬菜、水果及谷物的前处理实验，以及其他文献调研的结果[16,24]，本研究选取2 组通用型的净化填料进行对比实验：第1组为1 200 mg MgSO4、400 mg PSA和400 mg C18；第2组为885 mg MgSO4、150 mg PSA和15 mg GCB，每组做3 次平行。

由图2可知，2 组实验的平均加标回收率分别为87.7%～99.9%和76.4%～110.3%，除溴硫磷、蝇毒磷及残杀威外，其余9 种目标物在MgSO4＋PSA＋C18条件下净化，平均加标回收率更优。因此，本研究选择通用型净化包1 200 mg MgSO4、400 mg PSA和400 mg C18。

图2 2 种净化包对12 种农药平均加标回收率的影响 （加标量0.004 mg/kg）Fig. 2 Effect of two dispersive solid phase extraction kits on average recoveries of 12 pesticides at spiked concentration of 0.004 mg/kg

2.4 标准曲线和定量限

本研究采用内标法进行定量，将基质标准溶液依次进样后采集数据，以目标物和内标的定量离子对峰面积比值为纵坐标，二者之间的质量浓度比为横坐标，绘制标准曲线。

由表3可知，在5～200 ng/mL质量浓度范围内，12 种有机磷及氨基甲酸酯类农药的标准曲线线性关系良好，相关系数均大于0.99。12 种农药的定量限均为 0.004 mg/kg，满足信噪比（RS/N）≥10的要求。

表3 12 种农药的标准曲线和定量限Table3 Calibration curves and LOQs for 12 pesticides

2.5 方法回收率和精密度

选择空白豆乳样品进行0.004、0.008、0.040 mg/kg 3 个不同水平的加标实验，每个水平均做6 次平行，测定加标回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

由表4可知，12 种农药的加标回收率为71.8%～114.9%，RSD为4.6%～13.3%，说明该方法满足要求，适用于豆乳中目标农药残留的测定。在实际样品检测中，利用所建立的方法对市售的5 批次豆乳进行12 种有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测，结果均未检出。

表4 12 种农药的加标回收率及RSD（n＝ 6）Table4 Recoveries and RSDs for 12 pesticides (n = 6)

2.6 实际样品测定

随机抽取3 种常见豆乳产品进行检测，分别称取10 g植选浓香豆乳、植选植物乳、植选浓香豆乳（黑芝麻、黑豆），按照方法操作步骤进行12 种农药残留检测，结果均未检出，与样品实际情况相符，表明此方法适用。

3 结 论

本研究提供了一种同时测定豆乳中12 种有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的GC-MS/MS方法。在其他食品基质文献的基础上，采用QuEChERS前处理方法，在提取步骤中引入冷水浴降温方式，较好地提升了目标物的加标回收率；在净化步骤中对通用型净化包进行了加标回收率对比实验，确定了合适比例的净化包；同时采用内标法进行定量。方法学验证实验结果显示：12 种农药的定量限均为0.004 mg/kg，3 个不同添加水平下的加标回收率为71.8%～114.9%，RSD为4.6%～13.3%，加标回收率和精密度满足要求。该方法具有快速、高效、准确的优点，适用于豆乳中有机磷及氨基甲酸酯农药残留的测定，也可为其他植物乳中农药残留检测方法的研究及应用提供参考。