温度、水硬度、有机干扰物对过硫酸氢钾复合粉杀菌效果影响的研究

高 倩

（北京安洁康生物科技有限公司，北京，100071）

1 实验部分

1.1 材料与仪器

样品为白鲨牌过硫酸氢钾复合粉（北京安洁康生物科技有限公司出品）

-20 ℃冰箱（Haier BCD-223WDPT）

40 ℃烘箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂 GSP-9270MBE)

生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司 BSC-1100A2-X）

菌种：金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）

1.2 硫代硫酸钠中和法测试浓度

浓度测试方法依据《消毒技术规范》（2002版）[1]。具体步骤如下：

（1）取一份样品加适量水稀释，作为颜色对照。

（2）使用碘量瓶精确称量0.5 g样品（精确到0.0001），用10 ml纯化水溶解。

（3）加入10 ml的2 mol/L硫酸+水（质量比1︰15），摇匀。

（4）加入10 ml的100 g/L碘化钾溶液，摇匀，盖上玻璃塞，水封，放置暗处5 min。

（5）拔掉玻璃塞，用0.1 mol/L硫代硫酸钠滴定至溶液呈淡黄色，加入5 g/L淀粉溶液10滴，溶液立即变蓝色，继续滴定至蓝色消失，记录消耗硫代硫酸钠体积。过硫的百分含量计算如下：

其中X为过硫的百分含量，%；

C为硫代硫酸钠的浓度，mol/L；

V是消耗硫代硫酸钠的体积，ml；

m为称取的样品的质量，g。

（6）测试结果：白鲨牌过硫酸氢钾复合粉的有效含量为10.6%。

1.3 悬液定量杀菌法测试杀菌能力

1.3.1 菌种制备方法

（1）以无菌操作方式开启菌种管，用移液枪加入适量营养肉汤培养基，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0～10.0 ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37 ℃培养18～24 h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，置37 ℃培养18～24 h，挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，置37 ℃培养18～24 h，即为第3代培养物。

（2）取第3～6代的营养琼脂培养基培养18～24 h的新鲜斜面培养物，吸取3.0～5.0 ml0.03 mol/L磷酸盐缓冲液，加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0 ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用蜗旋振荡器混合20 s，或在手掌上振打80次，以使细菌悬浮均匀。

（3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需浓度。

（4）细菌繁殖体悬液应保存在4 ℃冰箱内备用，应当天使用不得过夜。

（5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化实验等法进行鉴定。

1.3.2 中和剂测试

（1）参照《消毒技术规范》第2002版[1]。选用中和肉汤作为中和剂，试验设置四组：

第1组 中和剂+硬水+菌悬液→培养

第2组 （消毒剂+中和剂）+菌液→培养

第3组 稀释液+硬水+菌悬液→培养

第4组 稀释液+中和剂+培养基→培养

（2）测试结果见表1。

表1 中和剂测试结果

从表1结果可知，中和肉汤可以作为过硫酸氢钾消毒液的中和剂。

1.3.3 杀菌能力测试

杀菌能力测试方法依据《消毒技术规范》（2002版）[1]，具体步骤如下：

（1）配制实验用菌悬液，使其菌体浓度达到1×108～5×108cfu/ml。

（2）按照测试要求配制消毒液（浓度=目标浓度×1.25），本实验使用消毒液浓度为1︰400，故实际稀释比例为1︰320。

（3）取消毒实验用无菌试管，先加入0.5 ml实验用菌悬液，再加入0.5 ml有机干扰物质，混匀，再吸取上述各浓度消毒液4.0 ml注入其中，迅速混匀并立即计时。

（4）待实验菌与消毒剂相互作用至20 min，分别吸取0.5 ml实验菌与消毒剂混合液加于4.5 ml中和剂中，混匀。

（5）各管实验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用10 min后，分别吸取1.0 ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。

（6）同时用标准硬水代替消毒液，进行平行实验，作为阳性对照。

（7）所有实验样本均在37 ℃恒温培养箱中培养，对细菌繁殖体培养48 h观察最终结果。

（8）实验重复2次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N），然后按下式计算杀灭对数值：

杀灭对数值（KL）＝对照组平均活菌浓度的对数值（No）—实验组活菌浓度对数值（Nx）

计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。但是，如果消毒实验组消毒处理后平均生长菌落数小于1时，本规范规定此时的杀灭对数值，即大于等于对照组平均活菌浓度的对数值（KL≥No）。

2 实验结果与讨论

2.1 实验结果

2.1.1 温度对过硫酸氢钾复合粉杀菌效果的影响

将白鲨牌过硫酸氢钾复合粉以1︰320稀释，分装于三个容器内，分别放置于4 ℃冰箱、室温（20 ℃）、40 ℃烘箱内，等温度稳定后使用悬液定量杀菌法在各自温度下杀菌20 min，结果见表2。

表2 不同温度下杀菌对数值

由表2可以看出过硫酸氢钾复合粉在常温下可有效杀灭金黄色葡萄球菌，但是低温会影响它的杀菌效果。因此我们使用两种方法来消除低温对过硫酸氢钾复合粉的影响，分别是延长杀菌时间和增加消毒液浓度。

由表3可以看出，通过提高消毒液浓度至1︰200或者延长杀菌时间至40 min都可以使过硫酸氢钾复合粉在低温下有效杀灭金黄色葡萄球菌。

表3 4℃条件下，不用浓度和不同作用时间下杀菌对数值

2.1.2 水硬度对过硫酸氢钾复合粉杀菌效果的影响

分别使用纯水、500 mg/kg硬水、1000 mg/kg硬水、2000 mg/kg硬水将白鲨牌过硫酸氢钾复合粉以1︰320稀释，使用悬液定量杀菌法杀菌20 min，结果见表4。

表4 不同水硬度下杀菌对数值

由表4可以看出，随着水硬度的增加，过硫酸氢钾复合粉的杀菌能力会逐渐降低。

2.1.3 有机干扰物对过硫酸氢钾复合粉杀菌效果的影响

将白鲨牌过硫酸氢钾复合粉进行1︰320稀释，进行悬液定量杀菌试验时分别以纯水、1.5 g/L、3g/L的牛血清白蛋白代替有机干扰物进行试验，杀菌20 min，结果见表5。

表5 不用有机干扰物浓度下杀菌对数值

由表5可以看出，有机干扰物会影响过硫酸氢钾复合粉的杀菌能力，但是在标准浓度下（3 g/L），过硫酸氢钾复合粉对金黄色葡萄球菌仍然有良好的杀菌效果。

2.2 结果讨论

2.2.1 温度对过硫酸氢钾复合粉杀菌效果的影响

实验结果表明，温度对过硫酸氢钾复合粉的杀菌效果影响比较大，而实际应用的环境温度根据一年四季温度的变化而变化，一般都在4～40 ℃之间（此消毒液不防冻，不能在0 ℃下使用），在常温下，消毒工作可按照正常的稀释比例和消毒时间操作；当冬天温度较低时，正常的浓度和杀菌时间条件下无法达到应有的杀菌效果，所以应根据本地的环境条件适当增加使用浓度或者延长消毒时间以便达到预期的消毒效果。

2.2.2 水硬度对过硫酸氢钾复合粉杀菌效果的影响

工厂稀释消毒剂时均会选用自来水，不同地区的水质区别也很大，因此在使用此消毒剂时应对本地区的水质进行测试，当水硬度过大时需要对消毒剂浓度或者消毒时间进行调整，或者可以将水进行处理后再配制成消毒剂。虽然水硬度对过硫酸氢钾复合粉的杀菌能力影响不是很明显，但是使用优质水进行稀释会更好地达到预期消毒效果。

2.2.3 有机干扰物对过硫酸氢钾复合粉杀菌效果的影响

工厂内部会有很多种类的有机干扰物，比如养殖动物的粪便，因此消毒前的清洁卫生就成了消毒质量的关键因素。虽然实验结果表明有机干扰物的存在不会对过硫酸氢钾复合粉的杀菌能力产生很大影响，但是如果有机干扰物的量过大的话依然会使过硫酸氢钾复合粉的杀菌能力下降，使消毒工作达不到预期的效果。因此，清洁是消毒的前提，在做消毒工作之前一定要先做好清洁工作。

3 结论

通过在不同温度、水硬度、有机干扰物浓度条件下进行过硫酸氢钾复合粉杀灭金黄色葡萄球菌的实验，我们发现过硫酸氢钾复合粉的杀菌能力受多种因素的影响。这些因素与地理位置、季节和其他一些原因变化有关，因此我们在选用此消毒液进行对环境消毒时，一定要考虑周围的环境因素，避免发生无法达到预期的消毒效果的情况。