基于Web of Science数据库禾草内生真菌生物碱论文计量统计分析

张若晨，李涛，姚祥，陈振江，李春杰*

（1.兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室，兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州730020；2.江苏省中国科学院植物研究所，南京中山植物园，江苏 南京210014）

禾草内生真菌是指在禾草中度过全部或大部分生命周期，而禾草不显示外部症状的一类真菌［1］。但是可通过组织学方法从严格表面消毒的植物组织中分离出内生真菌菌株［2-3］。关于植物内生微生物以及植物内生菌国际上已早有记载，但现代植物内生真菌研究的基础，形成于20世纪70年代林木内生真菌和禾本科植物内生真菌研究［4-6］。随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深入，禾草内生真菌的研究进入了快速发展阶段，其范畴不断扩大，在农业和医药领域中都具有很大的应用潜力，而且禾草内生真菌的研究内涵也在不断丰富，发挥了重要的生态和生理作用及其可作为潜在的生防资源和外源基因的载体［7-8］，这些使得禾草内生真菌已逐渐成为国内外研究的热点［9］。近几十年研究指出大部分禾本科植物均存在内生真菌［7］，禾草内生真菌可以促进宿主植物生长、增强植物的光合作用、合成植物激素［10］，除此之外禾草内生真菌还可以提高寄主植物的各种抗逆性，例如耐旱性［11］、耐盐性［12］、耐寒性［13］、抗病性［14］，并且能够促进禾本科植物吸收营养物质、还可以提高牧草产量［15］。

禾草内生真菌与宿主植物形成互惠互利共生体，而且绝大多数的内生真菌在宿主植物内会产生生物碱，对于生物碱的研究最早可以追溯到1944年，人们发现羊采食了黑麦草（Lolium perenne）后会出现类似麦角中毒的症状，Cunningham 等［16］报道称，引起家畜出现中毒症状的多年生黑麦草并没有被任何病害所侵染的迹象，此后又有多篇高羊茅（Festuca arundinacea）导致家畜中毒的报道问世［17］。20世纪60年代，人们从黑麦草和高羊茅等禾草中分离出了多种生物碱［18］。但是此后几年内国际上关于禾草内生真菌共生体使家畜中毒的原因与机制等方面的研究与报道较少［19］。直到20世纪70年代，人们又发现了感染内生真菌的一些禾本科植物如高羊茅、黑麦草等会引起牛、羊等家畜中毒，因此，对禾草内生真菌和生物碱生物学作用方面的研究逐渐引起大家的重视［20］。1981年报道了绵羊黑麦草结节病的暴发与多年生黑麦草中的两种神经毒素有关，这两种黑麦草中的代谢产物被分别命名为Lolitrem A 和Lolitrem B［21］。之后，新西兰与美国先后报道了高羊茅与黑麦草中内生真菌产生的数种生物碱，他们对内生真菌生物碱的研究大都集中在生物碱的分离、纯化、鉴别以及分子结构等方面［18］。20世纪初，Li等［22］发现，在中国北部广泛分布着一种对家畜具有毒性和麻醉性的禾草，即醉马草（Achnatherum inebrians），且他们发现醉马草对动物的毒性由甘肃内生真菌（Epichloë gansuensis）的代谢产物导致。2006年，Song 等［23］发现，被内生真菌感染的醉马草中含有大量的麦角碱类生物碱，包括麦角碱和麦角新碱。2007年，Zhang 等［24］发现，披碱草（Elymus dahuricus）内生真菌共生体可以产生波胺，且产碱量呈季节性变化，在10月最多，在6月几乎不产生生物碱。2011年Zhang 等［25］研究了刈割频率和刈割高度对于醉马草产生生物碱含量的影响；同年他又发现在盐胁迫或干旱胁迫下，醉马草内生真菌共生体仍会保持较高的产碱量，且麦角新碱比麦角碱的产量高［26］。2014年，Zhang 等［27］又发现，麦角生物碱对动物平滑肌细胞具有细胞毒性作用，且生物碱浓度越大，对细胞生长的抑制作用就越强。2015年，Zhou 等［28］评估了温度对3 种生态型中华羊茅（Festuca sinensis）麦角生物碱产量的影响，发现麦角碱和麦角新碱在短期的寒冷胁迫下会发生改变。2017年，Ekanayake 等［29］通过对高羊茅内生真菌共生体产生生物碱的基因组和代谢特征的研究，指出了通过DNA 分析发现和初步鉴定的内生真菌，进行代谢验证研究，这种方法可以提高产碱的速度和效率。2018年，Li 等［30］发现，白粉病和土壤水分条件显著影响醉马草内生真菌共生体的麦角碱产量。2019年，Lin 等［31］发现，季节变化和生态型对中华羊茅内生真菌共生体产碱量均有影响，且季节变化对生物碱浓度的影响比生态型更为显著。2020年，Cagnano 等［32］对欧洲不同地点收集的受Epichloë属内生真菌感染的禾本科植物进行基因分型测序（genotyping-by-sequencing），深入研究了寄主和内生真菌的遗传结构及其相互作用，结果表明，在植物和内生真菌亚群中，洛林生物碱和菌丝体生物量的浓度是相关的，并且存在个体差异。此外，Cagnano 等［32］还对基因分型测序是否值得用于Epichloë属内生真菌-禾草共生体做出了探讨，发现最大的限制是内生真菌对植物阅读的数量不成比例地低，因为真菌生物量远远低于植物生物量。同年，Cagnano 等［33］研究发现，近红外光谱法和化学计量学的结合使用可以定量检测禾草内生真菌共生体中的洛林生物碱含量和菌丝生物量。2019年，Caradus 等［34］综述了麦角碱浓度对新西兰牧草和反刍动物放牧草地的影响，论证了人工接种可以得到不表达麦角缬氨酸但仍产生麦角碱的内生真菌菌株，也就是对放牧动物低毒性且具有抗虫性的禾草内生真菌共生体。

目前人们发现的与禾草内生真菌有关的生物碱已有数10 种，例如，从黑麦草和草甸羊茅（Festuca pratensis）中分离的内生真菌分别可产生震颤素（Lolitrem B）［35］和黑麦草碱（Lolines）［36］，从醉马草中分离的甘肃内生真菌可以产生麦角酰胺和麦角新碱［37］。这些生物碱主要可以分为4 类，分别是吡咯并吡嗪类，代表物为波胺；麦角碱类，代表物有麦角碱和麦角新碱；吲哚双萜类，代表物有震颤素；以及饱和吡咯化合物，代表物主要是黑麦草碱［18］。

大多数生物碱对生物都具有毒性，只有波胺对哺乳动物没有毒性，而其中毒性最强的是麦角碱类和吲哚双萜类生物碱［38］。被内生真菌感染的高羊茅、黑麦草与醉马草通常会产生多种麦角碱，它不仅使所采食的动物中毒，还可改变动物的生理指标（体重、体温、血液中激素含量、肌肉纤维产量等），严重时会导致动物死亡。其中麦角新碱是导致家畜中毒的重要毒素，主要是因为麦角新碱对动物平滑肌细胞具有细胞毒性作用［27］。另一方面，虽然生物碱普遍具有毒性，但有研究表明，禾草内生真菌产生的生物碱可以增强寄主的抗逆性，如抗虫［39］、抗干旱等［40-42］。同时生物碱也阻止了家畜和草食性野生动物等对禾草的采食，起到了对物种多样性的保护作用［43］。而且生物碱还可增加寄主植物对于某些线虫的抵抗能力，在带有内生真菌的高羊茅生长的土壤内，多种线虫的群体数量均明显低于不带有内生真菌禾草生长的土壤［44］。因此，在人为的调控下，有望将各种优势继续扩大，使它在生物农业方面大放异彩。

我国植物内生真菌生物碱的研究始于20世纪90年代，并且在近年内对内生真菌生物碱展开一系列研究，发表了大量的文章，但是国内对于内生真菌生物碱的研究大多集中于药用植物和谷类作物［18］，对于禾本科植物内生真菌共生体产生生物碱的研究却相对较少，相反国外近年来十分关注对禾本科植物以及Epichloë属内生真菌的研究。因此，对于这一领域文献的计量统计分析，将有利于了解其发展状况。鉴于目前国内没有禾草内生真菌生物碱相关的文献计量分析，因此，本研究对2000-2019年这20年间Web of Science 数据库中的禾草内生真菌生物碱文章进行计量分析，旨在了解当前关于国际上禾草内生真菌生物碱研究的现状和发展趋势，为我国从事禾草内生真菌生物碱研究的各位科技工作者提供参考。

1 材料与方法

文献来自Web of Science 数据库（包括Web of Science 核心合集、BIOSISI Previews、KCI-Korean Journal Database、Russian Science Citation Index、sciELO Citation Index 5 个库），采用基本检索的方式，以“Epichloë，alkaloids”或者“Neotyphodium，alkaloids”为关键词，检索该数据库内2000-2019年间与禾草内生真菌生物碱有关的文献数据记录。经过筛选以后得到646 篇相关文献。本研究将对这些文献进行统计分析，主要分析指标有：发文所属国家、发文数量历年变化趋势、文章研究方向、发文所属机构、文献来源、文献被引用频次以及H 因子（hindex）等。其中H 因子是一个评价学术成就的新指标，它是指一名科研人员（国家或机构）至多有h 篇论文分别被引用了至少h 次。h 指数越高，则表明论文影响力越大。而文献被引频次则客观地反映了总体被使用和受重视的程度。

2 结果与分析

2.1 国际发文数量与所属国家分析

2000-2019年，Web of Science 数据库收录与禾草内生真菌生物碱研究相关的文献总计646 篇，统计了发文所属国家，共有36 个。然后，选取了发文数量前10 的国家进行分析（表1）。发现在发文数量与h-index 方面，美国、新西兰两国大幅领先其他国家，说明这两国在禾草内生真菌生物碱领域的研究进展与影响力处于国际顶尖水平。而平均被引次数却是中国（包括检索结果中的“China”与“Peoples Republic of China”）、德国和加拿大最多，说明中国、德国与加拿大也是关于禾草内生真菌生物碱研究的主要力量。

表1 2000-2019年发表禾草内生真菌生物碱文章数量前10 国家Table 1 Top 10 countries publishing articles on alkaloids of grass endophytic fungi from 2000 to 2019

相较于美国、新西兰等国家，我国关于禾草内生真菌生物碱的研究开始较晚，21世纪以后我国才开始此方面的研究，但是我国内生真菌生物碱的研究发展迅速，尤其是2011年后，相关文章数量明显增加（图1）。国内最早关于禾草内生真菌生物碱的介绍是Tan 等［45］2001年发表在Natural Product Reports 期刊（农林一区，IF2018=11.88）的《Endophytes：A rich source of functional metabolites》。该文章中主要介绍了3 种禾草内生真菌生物碱的分子结构、毒性及其来源，分别是胺类与酰胺类生物碱，吲哚衍生物类生物碱（这类生物碱对昆虫和哺乳动物有毒），以及吡咯烷类生物碱，以上生物碱均产生于内生真菌感染的禾草中，其中有些生物碱可以作为杀虫剂，但对哺乳动物的毒性较小［45］。此后数年，Tan 及其团队未对禾草内生真菌生物碱进行继续研究。而我国禾草内生真菌生物碱的研究领域内，南志标院士团队研究最为系统深入，发文量最多，推动了国内禾草内生真菌生物碱的研究，使这方面的研究从此进入快速发展的阶段。

图1 2000-2019年前三国家发文量年动态Fig.1 The dynamic of top 3 countries publishing articles on grass endophytic fungi during 2000 to 2019

2.2 相关发表文章所属机构分析

对检索出的关于内生真菌生物碱研究的646 篇科技论文，按照其所属科研机构进行分类，然后选取发文量前十的机构进行统计分析（表2），目前对于禾草内生真菌生物碱研究主要集中在高校和科研院所，其中肯塔基大学、西弗吉尼亚大学、梅西大学与兰州大学等对于内生真菌生物碱的研究较为深入，美国农业部与新西兰农业部对于内生真菌生物碱的研究较为重视。而且发文数量最多的几个机构分别属于美国、新西兰和中国，说明这3 个国家在该领域的研究处于世界前列。

表2 2000-2019年禾草内生真菌生物碱文章数量前10 机构Table 2 Top 10 institutions of publishing articles on alkaloids of grass endophytic fungi from 2000 to 2019

随后本研究对国内的33 篇生物碱相关文章进行统计分析（图2），发现国内对于禾草内生真菌生物碱的研究主要集中在高校，其中兰州大学对禾草内生真菌生物碱的研究最为深入和系统，共发表了23 篇相关文章，研究方向主要包括生物碱的提取和检测方法、生物碱的合成机理、生物碱对家畜的毒性、生物碱的组织分布、季节变化以及生物碱对共生体的生理生态作用等。20世纪国际上已对禾草内生真菌生物碱展开一系列的研究，研究报道主要集中在羊茅属禾草［46-48］、多年生黑麦草［1］以及睡眠草（Achnatherum robustum）［49］等。而21世纪以来，南志标院士团队扩展了对禾草内生真菌生物碱的研究范围，开始对醉马草［50-51］、披碱草［52］、野大麦（Hordeum brevisubulatum）［12，53］和中华羊茅［28，31］中的生物碱进行研究。

图2 2000-2019年国内机构发文情况Fig.2 The dynamic of domestic institutions publishing articles on grass endophytic fungi during 2000 to 2019

2.3 我国与国际发表文章的研究方向对比分析

目前关于内生真菌生物碱的研究已经延伸到了各个行业，包括植物科学、微生物学、化学、农业科学、基因学、病理与药理学等几十个研究方向，现在对检索出的关于内生真菌生物碱研究的646 篇科技论文，按照其研究方向进行分类（由于出现学科交叉现象，所以各个分类文章相加大于总数），选取发文量前10 的研究领域进行统计分析（表3）。其中关于植物科学（plant science）方面的论文数量最多，有526 篇，占总发文量的81.42%。而且禾草内生真菌生物碱相关的研究涉及范围非常广，主要集中在农学、环境生态学、微生物学、生物化学与分子生物学等研究领域。

表3 2000-2019年国际禾草内生真菌生物碱研究方向Table 3 Research areas on alkaloids of grass endophyte fungi from 2000 to 2019

而我国相关领域的33 篇文章中，最多的研究方向也是植物科学，有29 篇与之相关。我国关于内生真菌生物碱的研究主要集中在真菌学、生物化学与分子生物学、农学、环境生态学等领域，与国际目前的总体研究趋势一致。

2.4 我国相关文章的被引用情况统计分析

我国禾草内生真菌生物碱相关文章被引频次（包括自引）为67.67，远高于国际平均水平（24.63），说明我国的文章在国内外具有较高认可度。因此，本部分统计了我国被引用频次最高的6 篇文章（表4），并对其进行分析。其中《Endophytes：A rich source of functional metabolites》被引用的次数最多，有922 次，该研究主要介绍了内生真菌代谢物与生物碱的生物学特性，指出内生真菌是一种丰富可靠的生物活性和化学新化合物来源，具有巨大的药用和农业潜力，除了介绍禾草内生真菌生物碱以外，还介绍了其他多种内生真菌代谢物，因此被学者们广泛引用。而且从表中可以看出国内被引用前几的文章主要是介绍生物碱的生物学特征，生态作用以及影响禾草植物产碱量的因素。

表4 2000-2019年我国禾草内生真菌生物碱被引频次最高的6 篇文章Table 4 Top 6 most cited articles in the field of alkaloids of grass endophyte fungi in China from 2000 to 2019

2.5 我国相关文章的文献来源统计分析

收录我国的33 篇相关文章的期刊一共有25 个，再次说明了我国目前关于内生真菌生物碱的研究涉足领域十分广泛。目前国内发表在Natural Product Reports 的两篇文章，即《Endophytes：A rich source of functional metabolites》和《Biology and chemistry of endophytes》，是中国学者以第一作者的身份在禾草内生真菌生物碱领域所发表的影响因子最高的两篇文章，影响因子为11.876。收录我国该领域内文章最多的期刊是Frontiers in Microbiology，收录了3 篇文章。我国禾草内生真菌生物碱文章所发表的期刊影响因子多在2～4，影响因子在0～2 次之，而影响因子在4～6 以及影响因子＞6 的文章则相对较少（图3）。对收录国内禾草内生真菌生物碱文章的期刊进一步分析发现，发表我国文章超过一篇的期刊有7 个（表5），说明随着国内对于生物碱研究的不断深入，我国文章所发表的期刊水平逐年提高，陆续有文章发表于Journal of Agricultural and Food Chemistry（农林一区）、Natural Product Reports（化学一区）等高水平期刊。

图3 2000-2019年我国禾草内生真菌论文影响因子分布Fig.3 Distribution of impact factors of the articles on grass endophyte fungi published by Chinese scientists during 2000 to 2019

表5 2000—2019年我国内生真菌生物碱文章期刊（发表文章超过一篇）分布Table 5 The distribution of journals（publishing more than one article）on alkaloids of grass endophyte fungi in China during 2000 to 2019

3 总结与展望

目前由于真菌学、微生物学、分子生物学和基因遗传学的快速发展，以及近年来植物内生真菌生物碱在农业系统中的作用越来越受到重视，使得人们对于禾草内生真菌生物碱的研究取得了突破性的进展。比如，生物碱使宿主产生抗性的机制；不同禾草内生真菌共生体产生生物碱的类型及其对家畜的毒性作用；影响生物碱在植物中分布特点及浓度的因素；生物碱的人工合成途径等方面。

我国的禾草内生真菌生物碱研究已取得很大的进步，但国内的研究大都从21世纪初才开始，因此，关于禾草内生真菌生物碱的研究仍与美国、新西兰等国家存在差距。所以提出以下几方面建议，望研究者们可以克服困难，使我国禾草内生真菌生物碱的研究更加系统完善。

一、现阶段国内的研究虽然拓宽了对禾草内生真菌生物碱的研究领域，但是关于生物碱的基础研究相较于国外仍然比较薄弱，因此，研究者应对生物碱基础方面进行更为深入的研究。

目前国内生物碱使宿主植物产生抗性机制的研究大多是在受控环境中进行，试验结果可能只能证明寄主某种抗性的一般趋势，田间的情况可能与实验室中的记录存在差异。例如，抗虫性试验过程中模拟的植物施肥、土壤水分和温度条件都是对植物生长最有利的，这些因素都可能影响禾草内生真菌共生体与昆虫的相互作用结果，使试验结果不能准确反映田间禾草内生菌共生体对昆虫的影响［54］。因此，建议下一阶段重点研究在不受控制的真实田间环境下，探究生物碱对于宿主植物产生抗性的影响。

国内的相关研究证明环境温度和生物碱的剂量会影响生物碱中毒的发生，以及洛林生物碱是通过阻断钾离子与神经膜受体相互作用的通道致使家畜中毒［55］。但是生物碱对动物的毒性作用尚未完全清楚，而且对目前已知的4 种生物碱的致毒机理尚无更深入的研究。因此，接下来的此类研究应该着重从生物碱致毒机理方面入手，例如，从植物和动物组织中提取出生物碱进行离体研究，这可能为进一步揭示其致毒机理提供更多研究线索，为以后内生真菌的合理应用提供理论依据。

国内的研究者虽然进行了一系列影响植物中生物碱含量因素的研究（包括盐胁迫、干旱胁迫、刈割频率与刈割高度、寒冷胁迫以及季节变化的影响），但都是初步探讨，建议对这方面进行更多的研究，得到更为深入和有益的结果，为我国研究者进一步探索禾草内生真菌代谢产物奠定基础。

二、通过对国内近20年的禾草内生真菌生物碱研究文章进行分析，发现国内对于生物碱的定性和定量分析都是用高效液相色谱法或气相色谱法进行测定，这些方法测定结果固然准确，但是时间成本和人工成本相对较高。由于近红外光谱已经广泛用于牧草的常规分析，因此，国际上有研究建立了一种对洛林生物碱进行快速检测和定量分析的新型方法，此方法基于近红外光谱法（near infrared spectroscopy，NIRS），加上改进的偏最小二乘法，利用获得的近红外光谱建立了植物真菌生物量和生物碱含量的定量预测方程，最终定量计算禾草内生真菌样品中的洛林生物碱含量和菌丝生物量［33］。而且为筛选和分离得到自然产生的动物友好型菌株，以便日后再次接种优良品种，研究者必须对禾草内生真菌共生体进行大规模筛选，并对菌株进行特征描述和生物碱测定。相比国内研究大多采用的全基因组测序的方法，国外有研究采用的基因分型测序（genotyping-by-sequencing），其成本更低，更适合于大量的个体［32］。有关禾草内生真菌生物碱鉴定、定量分析、基因测序以及增加产量等方面的新技术和新方法的应用，减少了研究的成本，同时提高了效率。但是在目前统计的国内文献中，这些新技术和新方法很少被研究，因此建议国内研究者在加强对生物碱基础研究的同时，适当引入新的试验技术和研究方法，以更加明确内生真菌和宿主禾草之间的相互作用，加速人工接种以提高生物碱产量方面的研究，并为基因组关联的研究铺平道路。

三、近年来为提高生物碱的产量，使其更好地应用于农业和医药等领域，使得生物碱的生物合成和调控网络逐渐成为该领域研究和关注的重点。目前在生物碱合成方面的研究虽有进展，但是对于生物碱的生物学特性仍需更加深入的研究。由于生物碱的成分复杂，分离纯化的成本高，因此，有必要利用新兴的合成生物学研究人工合成的方法。目前现有的细胞工厂中已经构建了麦角生物碱的部分生物合成途径，并产生了相应的中间产物。但是这些中间产物产率很低而且与最终产物相差甚远。所以进一步优化细胞工厂途径、基因组编辑、提高工程宿主的酶活性和适应性、增加前体供应等是提高产量的关键［56］。我国亟待利用代谢工程技术实现生物碱的高效、大规模生产。

四、关于内生真菌生物碱的研究已经延伸到了各个行业，真菌学与其他学科间的相互协同与交叉研究已是目前研究的潮流与趋势，通过基因遗传学和植物科学的研究明确内生真菌与寄主植物的相互关系，推动了生物碱的发展。因此，建议国内未来的研究调查增加生物碱或产生生物碱的遗传潜力的测试，评估Epichloë和相关内生真菌的农业生态意义，加强生物碱与其他学科之间的共同研究。