p53和DNA损伤调节基因1在口腔癌组织中的表达及通过Wnt/β-catenin信号途径对口腔癌细胞自噬和凋亡的影响*

董庆旭 赵郑莉

（河南省第二人民医院口腔科，郑州 451100）

口腔癌占全部恶性肿瘤的1.9%～3.5%，头颈癌的4%～20%，发病率仅低于鼻咽癌[1]。目前，针对口腔癌的治疗方法与其他癌症类似，包括基因、免疫和肿瘤干细胞等新型治疗方法，但是疗效尚不能令人满意[2]。因此，进一步明确定口腔癌治疗靶标对于开发特异性分子靶向药物和评估口腔癌的预后至关重要。p53和DNA损伤调节基因1（p53 and DNA damage regulated gene 1，PDRG1）与各种细胞生理活动密切相关，包括细胞增殖、生长、凋亡、细胞周期调节和DNA损伤修复[3]。研究表明，PDRG1可作为致癌分子，例如，PDRG1在大肠癌组织和胃癌组织中高表达，同时在结肠癌的细胞中沉默PDRG1会影响癌细胞的生长[4]。Tao等[5]研究表明PDRG1可能通过介导ATM-p53信号通路来影响肺癌细胞的生长和放射敏感性。但PDRG1是否在口腔癌中表达和发挥功能尚不清楚。 因此，本研究检测了PDRG1在口腔癌组织及口腔癌细胞系中的表达，同时观察沉默PDRG1对口腔癌细胞增殖、自噬及凋亡的影响，为PDRG1在口腔癌进展中的作用及其作为新的治疗靶标提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 临床组织

收集2017年6月至2019年6月在河南省第二人民医院60例接受口腔癌切除手术的患者的癌组织标本及配对的癌旁组织，其中男性30例，女性30例；年 龄35～68岁，平均（53.21±5.34）岁。纳入标准：（1）符合2010年口腔颌面部恶性肿瘤治疗指南，经病理诊断确定为口腔癌（不受癌症分期及组织学类型限制）；（2）术前未接受抗肿瘤治疗，无其他部位恶性肿瘤，无认知功能障碍。所有患者术前均签署了知情同意书。所有组织标本都保存在-80℃直至使用。

1.2 细胞和主要试剂

正常人口腔角质形成细胞（NHOK）和口腔癌细胞系（SCC-4，SCC-25，SCC-15，SCC-9）购自中国科学院上海细胞生物学研究所。DMEM培养基和胎牛血清（美国Gibco公司）；TRIzol试剂、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis试剂盒、TB GreenTMPremix Ex TaqⅡ试剂盒（日本TaKaRa公司）；shNC和shPDRG1质粒（上海吉玛制药技术有限公司）；LipofectamineTM3000（美国Invitrogen公司）；Annexin V/PI试剂盒、RIPA裂解液、BCA试剂盒、PDRG1抗体（美国Abcam公司）；β-catenin抗体、c-myc抗体、cyclin D1抗体、GAPDH抗体、IgG-HRP抗体（美国Cell Signaling Technology公司）。

1.3 细胞培养和转染

NHOK细胞、SCC-4细胞、SCC-25细胞、SCC-15细胞和SCC-9细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，2 d更换1次培养基。

SCC-15细胞按照1×105个/孔接种在24孔板中，随机分为shNC组（转染shNC质粒）和shPDRG1组（转染shPDRG1质粒）。待细胞生长融合至60%时，按照LipofectamineTM3000转染试剂说明书进行转染，其中shNC和shPDRG1的转染终浓度为50 nmol/L。在37℃、5% CO2的培养箱中培养6 h后，更换新鲜的培养基继续培养。48 h后结束培养，收集各组细胞进行后续实验。

1.4 细胞集落形成实验检测细胞增殖

培养结束后的各组细胞经胰酶消化以5×102个/孔接种于6 cm细胞培养皿中。14 d后，用4%多聚甲醛固定并用0.1%结晶紫染色，计数含有≥50个细胞的集落，显微镜拍摄代表性集落并统计。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

培养结束后的各组细胞，离心并重悬于缓冲液中。细胞依次Annexin V溶液10 μL和PI溶液10 μL染色，之后将细胞在室温下黑暗环境中孵育30 min，然后使用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。

1.6 电镜观察细胞自噬体的数量

各组细胞培养结束后吸去上清，PBS洗涤，加入2.5%戊二醛固定过夜，再加入1%锇酸后固定2 h，依次用50%、70%、90%、100%的丙酮脱水，包埋、染色后，用透射电子显微镜观察细胞自噬体的数量。

1.7 qRT-PCR检测PDRG1的mRNA水平

TRIzol试剂提取组织样本或细胞中的总RNA，紫外分光光度计检测总RNA浓度。使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA；使用SYBR Premix EX TaqTMⅡ试剂盒进行qRT-PCR。使用StepOnePlus实时PCR系统完成实验后，采用2-△△Ct法分析数据。所用引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物

1.8 免疫印迹检测PDRG1、LC3A/B 、β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白

RIPA裂解液提取组织样本或者细胞中的总蛋白，通过BCA法测定总蛋白含量，并将配对的样品调节至相同浓度。样品经变性后，采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并转移到PVDF膜上。室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，之后将PVDF膜分别与以下抗体在4℃孵育过夜：PDRG1抗体（1∶1 000）、LC3A/B 抗体（1∶1 000）、β-catenin抗体（1∶1 000）、c-Myc抗体（1∶1 000）、cyclin D1抗体（1∶1 000）和GAPDH抗体（1∶2 000）。随后，将PVDF膜用TBST洗涤3次，并与IgG-HRP抗体（1∶4 000）孵育1 h，TBST洗涤3次。最后显影曝光，Image-Pro Plus图像分析系统对蛋白条带的灰度值进行分析。

1.9 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行，正态分布数据资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验，率的比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PDRG1在口腔癌组织和口腔癌细胞系中的表达

qRT-PCR结果显示，与癌旁正常组织相比，PDRG1 mRNA在口腔癌组织中表达增加（P<0.01，图1A）；与NHOK组细胞相比，PDRG1 mRNA在口腔癌细胞系中的表达明显增加（P<0.01，图1C）。免疫印迹检测结果显示，与癌旁正常组织相比，口腔癌组织中PDRG1蛋白表达水平上调（P<0.01，图1B）；与NHOK组相比，PDRG1蛋白在口腔癌细胞系中表达明显上调（P<0.01），其中SCC-15细胞中PDRG1的表达水平最高（P<0.01，图1D），因此后续实验选择SCC-15细胞。

2.2 在SCC-15细胞中沉默PDRG1

与shNC组相比，shPDRG1组SCC-15细胞中PDRG1 mRNA的表达显著下降（P<0.01，图1A），PDRG1蛋白的表达水平明显下调（P<0.01，图1B）。

图1 PDRG1在口腔癌组织和口腔癌细胞系中的表达

图2 沉默PDRG1在SCC-15细胞中的表达

2.3 沉默PDRG1对SCC-15细胞增殖能力的影响

细胞集落形成实验结果显示（图3）：与shNC组相比，shPDRG1组SCC-15细胞的集落数目明显减少（P<0.01）。

图3 沉默PDRG1对SCC-15细胞增殖能力的影响

2.4 沉默PDRG1对SCC-15细胞自噬的影响

免疫印迹结果显示（图4A）：与shNC组相比，shPDRG1组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例减少（P<0.01）；电镜结果显示（图4B）：与shNC组比较，shPDRG1组细胞中自噬体数量减少。

图4 沉默PDRG1对SCC-15细胞自噬的影响

2.5 沉默PDRG1对SCC-15细胞凋亡率的影响

细胞流式术结果显示（图5）：与shNC组相比，shPDRG1组SCC-15细胞的凋亡率明显提高（P<0.01）。

2.6 沉默PDRG1对Wnt/β-catenin信号途径的影响

免疫印迹结果显示，与shNC相比，shPDRG1组SCC-15细胞中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表达水平下调（P<0.01）（图5）。

图5 沉默PDRG1对SCC-15细胞凋亡率的影响

图6 沉默PDRG1对Wnt/β-catenin信号途径的影响

3 讨论

口腔癌是头颈部肿瘤中常见的恶性肿瘤，是口腔内发生的恶性肿瘤之一，也是预后差的恶性肿瘤之一[6]。尽管口腔癌的预后和治疗方面取得了巨大进步，但该癌症的5年生存率仍低于63%[7]。研究表明，男性患口腔癌的几率比女性高，其原因可能是男性吸烟或酗酒史的人群所占的百分比较高。目前，针对口腔癌的治疗方法与其他癌症类似，主要包括手术切除、放疗、化学疗法或中药治疗，但是尚未达到令人满意的疗效。因此，迫切需要找到新的鉴定口腔癌标志物并探索口腔癌治疗的新策略。

PDRG1位于20号染色体的长臂上，编码存在于细胞质中不同亚细胞区室的133个氨基酸的蛋白质[8]。研究表明，PDRG1在多种恶性肿瘤中的表达均高于正常组织，比如结肠癌、直肠癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和子宫癌等[4]。Zhang等[9]研究表明PDRG1基因沉默可能通过激活ATM/p53途径抑制胃癌细胞的生长和转移。Wang等[8]研究表明，miR-214可以下调癌基因PDRG1从而在膀胱癌中发挥肿瘤抑制作用，并为膀胱癌的预后和治疗干预提供了新指标。我们的实验数据表明，PDRG1在口腔癌组织和口腔癌细胞系中高表达，接着我们构建了PDRG1低表达的稳定SCC-15细胞株，发现沉默PDRG1使SCC-15细胞的增殖能力下降，表明沉默PDRG1可抑制SCC-15细胞的活力。

自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，借此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新，维持机体内环境稳定[10]。Lin等[11]研究表明，熊果酸能抑制自噬、诱导凋亡和抑制迁移从而在口腔癌细胞中发挥抗增殖作用；Wang等[12]研究发现，乙酰紫草素通过诱导自噬、程序性细胞死亡和靶向m-TOR/PI3K/Akt信号通路来抑制顺铂耐药的口腔癌细胞的体内外肿瘤发生。然而PDRG1在口腔癌细胞自噬中研究甚少，因此，本实验进行了进一步研究。结果发现，沉默PDRG1明显抑制SCC-15细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达比例的下调，减少SCC-15细胞中自噬体数量，表明沉默PDRG1对SCC-15细胞自噬有抑制作用。

细胞凋亡也称为"固缩坏死"、"程序性细胞死亡"或"细胞自杀"，是由基因介导的一系列变化[13]。凋亡最初由特征性的形态变化来确定，包括：DNA的程序性降解、染色质浓缩、细胞缩小和碎裂。它可以是生理性的，或由化疗药物及放射诱发。Li等[14]研究表明，沉默miR-155可上调Foxo3a表达，从而抑制口腔癌细胞增殖、促进细胞凋亡，并增强口腔癌细胞中的DDP敏感性。因此，本实验也检测了沉默PDRG1对SCC-15细胞凋亡率的影响，结果表明，沉默PDRG1明显促进SCC-15细胞的凋亡率，但是具体的机制有待进一步研究。

Wnt/β-catenin信号通路是一种高度保守的分子机制，在形态发生、基因转录、分化和增殖的发育中起关键作用[15]。研究发现Wnt/β-catenin信号通路在各种类型的肿瘤和癌症中均被异常激活[16]，可能通过调节其下游靶标如cyclin D1，c-Myc，GSK-3等因子参与调控。此外，Wnt/β-catenin信号通路活性的改变与细胞自噬和凋亡有关[17]。近几年在口腔癌细胞中发现了β-catenin的转录活性上调[18]。但是PDRG1是否通过Wnt/β-catenin信号通路在口腔癌细胞中发挥作用尚未报道。因此，本研究结果显示，沉默PDRG1使SCC-15细胞中的β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白水平降低。上述结果表明，PDRG1可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路在口腔癌中发挥作用。

综上所述，PDRG1在口腔癌组织和口腔癌细胞系中高表达。沉默PDRG1可以抑制SCC-15细胞的增殖与自噬，并促进SCC-15细胞凋亡，而且抑制Wnt/β-catenin信号途径的激活。因此，PDRG1具有作为口腔癌诊断生物标志物的潜在价值，也可能成为口腔癌治疗的希望靶标。