高浓度臭氧胁迫两种园林观赏草的逆境生理特征比较

杨吉兰, 徐 胜, 马长乐, 韩志松, 李 夺, 李 岩, 王 楠, 王义婧, 何兴元,

1 西南林业大学园林园艺学院, 昆明 650224 2 中国科学院森林生态与管理重点实验室, 中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 110016 3 辽宁省农业科学院沙地治理与利用研究所, 阜新 123099 4 中国科学院沈阳树木园, 沈阳 110016 5 国家林业局西南风景园林工程技术研究中心, 昆明 650224 6 北京绿京华生态园林股份有限公司, 北京 102209

臭氧(O3)是地球大气成分中的一种微量气体,其主要集中在平流层,对流层中的含量仅占整个大气层O3总量的10%左右[1]。然而,近年来的经济快速发展和工业能源大量消耗引起臭氧前体物(NOx、 VOCs)的排放量增加,这使得对流层臭氧浓度不断升高。在我国很多地区O3浓度已成显著增加趋势,特别是在经济发展迅速、人口密集的地区,O3污染更为严重[2- 3]。2019年《中国环境公告》显示,全国338个地级及以上城市的O3日最大小时平均第90百分位浓度已达到了69 nmol/mol[4],超过了O3对植物造成影响的临界值[5]。因此,城市近地表O3浓度升高会对城市绿地及园林植物的生长及发育产生潜在风险或胁迫[6- 7]。

研究表明,O3浓度过高一方面会引起植物气孔关闭,限制CO2进入植物叶片[8],降低叶绿素含量,进而引起净光合速率下降[9]；另一方面,O3的强氧化作用,可引起植物体内代谢紊乱及伤害症状,增加细胞膜透性,导致大量的活性氧积累,引起细胞膜脂过氧化反应[10]。

近年来,国内外学者在O3对农作物、树木及草坪草生理生态的影响方面做了大量研究[11- 15],但在高浓度O3对观赏草的影响方面鲜有研究和报道。观赏草是一类色彩丰富、形态美丽、主要观赏茎杆和叶丛的草本植物的统称,以禾本科为主,其次是莎草科[16]。观赏草作为当前新兴的一类园林景观设计新材料,花序独特,易栽培,病虫害少,抗逆性强,适于粗放管理等特点,在各种园林生态景观配置中具有较高的观赏性和实用性[17- 19]。白穗狼尾草(Pennisetumalopecuroides′White′)和拂子茅(Calamagrostisepigeios)为多年生禾本科草本植物,因二者形态优美,根系发达,株丛分枝能力强,常常被作为景观草在园林绿化、生态修复治理等方面被大量应用。因此,本实验采用开顶式气室模拟O3浓度升高,通过气体熏蒸,研究不同高浓度O3处理下这两种观赏草叶片的逆境生理特征,分析和比较二者的耐O3能力,为O3污染下这类植物的引种栽培及其在园林生态景观中的应用等方面提供技术指导及科学依据。

1 研究地区与研究方法

1.1 研究地区概况与试验设计

试验地位于沈阳城区商业文化中心中国科学院沈阳应用生态研究所树木园内(123°26′E,41°46′N),地势平坦,土层深厚肥沃,属温带半湿润大陆性季风气候,四季分明,雨热同季。试验主要设备为正八边形开顶箱(OTC,北京前景惠邦控制技术有限公司设计)以及与之配套的通气、通风设备,OTC内设有O3发生器(XH- 2000,国产)、O3传感器(S- 905,新西兰)、温湿度传感器及数据分析与自动控制系统(CR- 800,Campbell Scientific Inc., 美国,北京华益瑞科技有限公司进口代理)。实验设置一个对照组(CK),自然O3浓度约40 nmol/mol；三个高O3浓度(EO)梯度组：80 nmol/mol(EO- 80)、120 nmol/mol(EO- 120)和160 nmol/mol(EO- 160)。

试验选取白穗狼尾草和拂子茅作为研究对象,该试验材料由北京绿京华生态园林股份有限公司提供,采用上口径28 cm,高30 cm的聚乙烯塑料盆进行种植,于2019年5月开始进行室外缓苗,8月5日挑选长势均匀一致的盆栽白穗狼尾草和拂子茅各24盆,随机分为4组,每组6盆,分别放入CK、EO- 80、EO- 120和EO- 160的开顶箱内进行熏蒸。从8月5日开始,每天09:00—17:00往开顶箱中通气(阴雨天等恶劣天气停止熏蒸),在试验期间各开顶箱每日8小时平均O3浓度,如图1所示。整个处理期OTCs内管理方法一致,水肥等条件控制一致。试验于实际熏蒸的第7天(8月22日)、14天(8月31日)、21天(9月11日)测定叶片的光合气体交换参数及各项生理指标。

图1 试验期间不同处理下开顶箱内每日8 h臭氧浓度均值Fig.1 Average daily ozone concentration of 8 hours in open top chambers under different treatments during the experiment

1.2 观测指标及方法

1.2.1光合气体交换参数的测定

于实际熏蒸的第7、14、21天分别测定叶片的光合气体交换参数,选择晴朗天气的09:00—12:00测定。选取无叶片遮挡,挑选健康无病虫害、大小均匀、叶色一致的,顶端向下第3—5个成熟叶片的中段部分,采用LI- 6400便携式光合测定仪(固定红蓝光源,设定光合有效辐射PAR=1200 μmol m-2s-1)测定净光合速率Pn和气孔导度gs。每个处理的光合气体交换参数指标测定3个叶片,每片叶子计测10次。

1.2.2生理指标的测定

光合色素含量采用乙醇混合液法[20]；丙二醛(MDA)含量：采用硫代巴比妥酸(TBA)法[20]；可溶性蛋白含量：采取考马斯亮蓝染色法[20]；超氧化物歧化酶(SOD)活性：采用氮蓝四唑法[21]；POD活性：采用愈创木酚比色法[22]。不同处理下,各生理指标进行3次重复。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010统计处理数据、计算平均值和标准差,结合SPSS 22.0软件,运用单因素方差分析(one-way ANOVA)的Duncan多重比较法,分别对同一时间不同浓度O3处理的各项生理指标进行分析,比较各指标的处理与对照间差异显著性(显著性水平设为0.05),运用重复测量分析时间与O3浓度之间对各指标的交互作用,使用Origin 9.1软件制图。计算各指标的变化率=处理值-对照值)/对照值,对变化率进行主成分分析[23],比较植物的耐O3性。

2 结果与分析

2.1 高浓度O3胁迫下两种园林观赏草叶片光合色素含量变化

图2 O3浓度升高对白穗狼尾草和拂子茅叶片叶绿素和类胡萝卜素含量的影响Fig.2 Effects of elevated O3 concentrations on the contents of chlorophyll and carotenoid in leaves of P. alopecuroides ′White′ and C. epigeios 柱状图上不同小字母表示同一处理时间不同O3浓度处理之间差异显著,不同大写字母表示同一O3浓度处理不同处理时间之间差异显著(P <0.05);* P<0.05; ** P<0.01

如图2所示,处理7 d、14 d时,白穗狼尾草叶片叶绿素总量在EO- 120和EO- 160熏蒸下较CK呈显著下降趋势；处理21 d时,在EO- 80、EO- 120和EO- 160下较CK均下降显著,其中EO- 160下降幅度为46%,达到最大(P<0.05)。与CK相比,处理14 d时EO- 160下拂子茅叶片叶绿素总量显著下降22.8%(P<0.05)；处理21 d时,EO- 120和EO- 160熏蒸使得叶绿素含量分别较CK显著下降23.3%和26.4%(P<0.05)。白穗狼尾草叶片类胡萝卜素含量随O3浓度升高,与CK相比呈下降趋势,在处理7 d时EO- 160熏蒸显著下降了22.9%(P<0.05),但在处理14 d,21 d时变化不显著。拂子茅叶片类胡萝卜素含量在处理21 d时,与CK相比,EO- 80、EO- 120和EO- 160熏蒸下分别显著下降20.1%、26.0%和33.9%(P<0.05)。O3和处理时间单独对两种观赏草叶绿素总量的影响存在极显著差异(P<0.01),二者交互仅对拂子茅叶绿素总量的下降影响显著(P<0.05)。

2.2 高浓度O3胁迫下两种园林观赏草叶片光合气体交换参数变化

不同浓度的O3熏蒸均使得两种观赏草叶片Pn和gs较CK呈下降趋势,这表明O3胁迫抑制了两种植物的光合作用。如图3所示,与CK相比,处理7 d、14 d和21 d时,EO- 80、EO- 120和EO- 160熏蒸下白穗狼尾草叶片Pn均呈显著下降趋势,其中在EO- 160处下降幅度分别达到最大,为84.4%、50.3%和61.3%(P<0.05)。拂子茅叶片Pn在处理7 d、14 d时,EO- 120和EO- 160熏蒸下较CK均呈显著下降趋势；处理21 d时,EO- 160下Pn较CK显著下降43.0%(P<0.05)。白穗狼尾草叶片gs在处理7 d、14 d时,与CK相比,EO- 120和EO- 160熏蒸下gs呈显著下降趋势；处理21 d时,EO- 160下降27.3%(P<0.05)。拂子茅叶片gs在处理7 d时,EO- 120和EO- 160下较CK分别显著下降57.0%和59.1%(P<0.05)；处理14 d时,gs较CK分别显著下降32.8%和41.8%(P<0.05)；处理21 d时,EO- 160下gs显著下降28.2%(P<0.05)。O3、时间及二者交互对白穗狼尾草和拂子茅叶片Pn和gs均存在极显著影响(P<0.01)。

图3 O3浓度升高对白穗狼尾草和拂子茅叶片净光合速 率(Pn)和气孔导度(gs)的影响Fig.3 Effects of elevated O3 concentrations on net photosynthetic rate (Pn) and stomatal conductance (gs) in leaves of P. alopecuroides ′White′ and C. epigeios

2.3 高浓度O3胁迫下两种园林观赏草叶片MDA含量变化

如图4所示,与CK相比,在EO- 160处理7 d、14 d和21 d时,白穗狼尾草叶片MDA含量分别显著上升72.7%、129.9%和30.2%(P<0.05)。高浓度O3胁迫对白穗狼尾草产生严重的氧化伤害,并随处理时间延长,膜脂过氧化程度增强。在整个试验期间,不同浓度O3熏蒸下,拂子茅叶片MDA含量与CK相比呈上升趋势,但无显著差异(P>0.05),说明拂子茅对O3胁迫有一定的抗性。

图4 O3浓度升高对白穗狼尾草和拂子茅叶片丙二醛(MDA)含量的影响Fig.4 Effects of elevated O3 concentrations on malondialdehyde (MDA) content in leaves of P. alopecuroides ′White′ and C. epigeios

2.4 高浓度O3胁迫下两种园林观赏草叶片可溶性蛋白含量变化

如图5所示,处理7 d、14 d时,在EO- 160下白穗狼尾草叶片可溶性蛋白含量较CK分别显著下降12.5%和28.1%；处理21 d时,在EO- 120和EO- 160下分别较CK显著下降24.2%和43.1%。拂子茅在处理14 d时,EO- 120和EO- 160下叶片可溶性蛋白含量分别较CK显著下降9.8%和11.9%；处理21 d时,在EO- 80、EO- 120和EO- 160下分别较CK显著下降12.0%、19.0%和22.9%。在O3浓度与时间交互作用下,前者对白穗狼尾草叶片的可溶性蛋白产生极显著影响(P<0.01)；O3单独处理对拂子茅叶片的可溶性蛋白产生显著影响(P<0.05)。

图5 O3浓度升高对白穗狼尾草和拂子茅叶片可溶性蛋白含量的影响Fig.5 Effects of elevated O3 concentrations on soluble protein content in leaves of P. alopecuroides ′White′ and C. epigeios

2.5 高浓度O3胁迫下两种园林观赏草叶片保护酶活性变化

由图6可知,两种观赏草叶片SOD活性随处理时间延长和O3浓度增加,均呈先升后降趋势,POD活性呈下降趋势。在处理7 d和14 d时,EO- 160熏蒸下白穗狼尾草叶片的SOD活性较CK显著上升了41.5%和50.4%(P<0.05)；处理21 d时,EO- 120和EO- 160熏蒸下SOD活性较CK分别显著下降21.6%和33.9%(P<0.05)。拂子茅在处理7 d时,EO- 120和EO- 160熏蒸使得该草叶片SOD活性较CK显著上升117.8%和142.6%(P<0.05)；处理21 d时,EO- 160熏蒸下叶片SOD活性较CK显著下降23.8%(P<0.05)。白穗狼尾草在EO- 160熏蒸处理7、14、21 d时,叶片POD活性较CK显著下降28.4%、63.5%和58.9%(P<0.05)。拂子茅叶片POD活性在处理14 d时,EO- 80、EO- 120和EO- 160下分别较CK显著下降24.2%、25.5%和35.7%(P<0.05)；处理21 d时,POD活性较CK在EO- 80、EO- 120和EO- 160下分别显著下降19.5%、32.3%和35.3%(P<0.05)。O3、时间及二者交互作用对两种观赏草叶片SOD和POD活性均产生了显著影响(P<0.05)。

图6 O3浓度升高对白穗狼尾草和拂子茅叶片超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性的影响Fig.6 Effects of elevated O3 concentrations on superoxide dismutase (SOD) and peroxidase (POD) activities in leaves of P. alopecuroides ′White′ and C. epigeios

2.6 两种园林观赏草对高浓度O3胁迫的抗逆性综合评价

利用SPSS 22.0对标准数据进行主成分析,按主成分特征值大于1的原则提取2个主成分,累积贡献率达到78.73%,很大程度上代表了原始指标信息。由表1可知,主成分1特征向量为3.96,贡献率为49.44%,包括了叶绿素含量、类胡萝卜素含量、Pn、可溶性蛋白、POD等指标的信息；主成分2特征值为2.34,贡献率为29.29%,包括了gs和SOD指标的信息。根据主成分的特征向量计算出这两种观赏草的抗逆性得分,主成分综合得分越高,表明该植物对环境因子的胁迫反应表现越不敏感,即能表现出较好的抗逆性。反之,则表现敏感,抗逆性较差[24]。如表2所示,白穗狼尾草在EO-80、EO-120和EO-160浓度下的得分分别为0.92、-1.06和-2.55,拂子茅在EO-80、EO-120和EO-160浓度下的得分分别为1.15、1.05和0.49,在各浓度处理下两种观赏草的综合得分拂子茅大于白穗狼尾草,表明拂子茅耐O3胁迫的能力强于白穗狼尾草。

表1 O3胁迫下两种观赏草逆境生理指标的特征向量

表2 两种园林观赏草对O3胁迫的抗逆性综合评价

3 讨论

3.1 高浓度O3胁迫对两种园林观赏草叶片光合特征的影响

叶绿体色素是植物光合作用的关键物质和有机营养的基础,其中叶绿素和类胡萝卜是重要的光合色素,光合色素含量下降意味着叶片光合能力降低[25- 26]。一般来说,高浓度O3胁迫会对植物的光合色素含量产生负面影响[27]。在本研究中,两种观赏草叶片的类胡萝卜素含量随着O3浓度的升高均没有明显的变化,这与类胡萝卜素在叶绿体中除了传递光合能量外,还能保护受光激发的叶绿体免受氧化作用破坏,在一定程度上保护光合膜,使光合作用在受到胁迫时仍能顺利进行等有关[28]。在高浓度O3胁迫下,白穗狼尾草的叶绿素含量比拂子茅下降得快,表明白穗狼尾草对O3升高比较敏感,而清除活性氧ROS的能力较弱。植物叶片大量ROS的积累,对叶绿素造成氧化破坏,引起叶绿素的合成减少,降解速度加快[29]；在逆境胁迫初期,拂子茅表现出较强的抗氧化能力,能在一定程度上保护叶绿体结构不被破坏,这与陶汉成等[30]对紫丁香叶片的研究结果相一致。

光合作用是绿色植物获取物质和能量的最基本来源,植物净光合速率是衡量植物生产力的指标之一。大量研究表明,O3浓度升高会降低植物的净光合效率。例如Yu等[31]的研究发现,在O3浓度为150 nmol/mol的胁迫下闽楠(Phoebebournei)、刨花润楠(Machiluspauhoi)和红豆杉(Taxuschinensis)的叶片Pn显著下降；王义婧等[32]对美国薄荷(Monardadidyma)的研究也发现,O3浓度在120 nmol/mol下处理7 d时,薄荷叶片Pn开始显著下降。本研究结果也表明,在O3浓度为160 nmol/mol的胁迫下两种观赏草叶片Pn显著降低。植物叶片内的O3滞留不仅引起净光合效率下降,还会诱导叶片气孔关闭及阻力增加[33]。本研究结果表明,两种观赏草叶气孔导度随着O3浓度的升高呈下降趋势。高浓度O3能够刺激气孔关闭从而避免更多的O3进入叶片内部,这是植物对逆境胁迫的应激响应[34- 35]。同时,气孔导度降低也使得植物体本身得不到足够的光合原料供应,Rubisco活性受损导致叶片内部CO2积累,导致光合作用减弱[36- 37]。

3.2 高浓度O3胁迫对两种园林观赏草叶片氧化伤害、可溶性蛋白含量及抗氧化酶活的影响

高浓度O3胁迫不仅破坏植物的光合色素,抑制光合作用,还诱发植物细胞内活性氧浓度增加而导致氧化胁迫[38]。MDA是植物抵抗逆境膜脂过氧化的产物,是衡量植物细胞膜脂过氧化程度大小最常用的指标[13]；本研究表明,白穗狼尾草在高浓度O3处理下MDA含量显著增加,这与秦子晴等[15]对醉蝶花(Cleomespinosa)以及Antonella等[39]对石榴(Punicagranatum)的研究结果一致。这表明长时间的高浓度O3熏蒸诱发了植物叶片体内活性氧的累积,加速了其膜脂过氧化作用,导致膜结构破坏,透性增大。本研究表明,拂子茅MDA含量随O3浓度增加呈缓慢上升趋势,但较对照组无显著变化。Xu等[40]的研究结果也表明高浓度O3胁迫下,银杏(Ginkgobiloba)和华山松(Pinusarmandii)叶的MDA含量较对照组均没有显著增加。MDA含量的不显著变化表明了植物具有较强的抗氧化能力,对臭氧胁迫具有一定的耐受性。

研究表明,O3胁迫下大部分植物可溶性蛋白含量呈下降趋势[28]。本研究结果与前人一致[41],两种观赏草随O3浓度的升高可溶性蛋白含量较对照均呈显著下降趋势,导致植物可溶性蛋白含量下降的原因主要分别为两方面：一是O3进入植物细胞后促进了蛋白水解酶的活性,加强了原有蛋白质分解,从而使蛋白质含量下降；二是O3对蛋白合成的众多酶系均有毒害和氧化作用,并且会使蛋白质合成的相关细胞器如细胞核核仁等受到损伤,抑制了新蛋白的合成[41]。

3.3 两种园林观赏草对高浓度O3胁迫的主成分分析

植物对逆境环境的适应程度由多个生理生化指标共同决定,由于各指标间的相关性,统计数据所反映的信息具有重叠性[45]。主成分分析主要将多指标转化为数个主成分,其中每个主成分能够携带大部分原始变量信息,且不重复[23]。张志伟[46]选取相对电导率、叶片含水量、POD、MDA、可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)、游离脯氨酸(Pro)等7个生理指标对5种棕榈科苗木的抗寒性进行主成分分析,结果表明布迪椰子(Butiacapitata)抵御低温能力最强,美丽针葵(Phoenixroebelenii)抵御低温能力最弱；Yan等[47]对苹果砧木的抗寒性选取可溶性淀粉、花青素、SS、SP、Pro、SOD、POD、MDA等指标进行主成分分析,筛选出抗寒能力最强的砧木,综合评价后的结果与其观察结果一致。本研究中主成分综合得分显示,两种观赏草对大气O3胁迫的耐受能力表现为拂子茅高于白穗狼尾草,这与试验中测定的主要生理生化指标变化规律中反映出的结果相一致,表明基于主成分分析法对叶绿素含量等8个指标综合评价植物抗性结果是可靠的,主成分分析可以适用于观赏草的耐O3能力的综合评价。

4 结论

在不同高浓度O3胁迫下,两种观赏草均受到了不同程度的影响,其生理响应特征基本一致,但也存在一定种间差异。基于生理特征比较及主成成分分析表明,拂子茅的耐O3能力强于白穗狼尾草,原因在于拂子茅在臭氧胁迫初期具有较强的抗氧化能力及适应臭氧的气孔调节能力,从而减缓了O3对其的氧化胁迫及伤害。因此,在臭氧高污染地区拂子茅会具有更高的应用潜力。