羊肉冷藏期间蛋白与脂质氧化及风味变化分析

何晓娜，杨晓玲，王宏博，席 斌，王 芳，李维红，郭天芬，高雅琴,

（1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃兰州 730050；2.农业部畜产品质量安全风险评估实验室，甘肃兰州 730050）

羊肉富含多种维生素、矿物质及人体必需的不饱和脂肪酸（PUFAS）[1]，具有较高的经济价值。随着国民生活水平的提高及膳食结构的改变，人们对冷鲜羊肉的需求量不断上涨。目前，用于羊肉贮藏的温度控制方式有冷藏、冰温、微冻和冷冻四种[2]。冷冻过程中肉品产生一系列不良的物理化学变化导致肉品品质较差，且设备能耗高[3]；冰温和微冻条件下的肉品品质较好，贮藏期限较长，但现阶段冰温和微冻贮藏设备较为昂贵且数量较少，在我国并没有广泛应用到肉品的贮藏中[4]；我国在保证肉品品质的情况下最常用的贮藏方式仍然为4 ℃冷藏。

氧化是导致肉品质劣变的一个重要原因，肉类氧化变质主要是由脂质和蛋白质的氧化及二者之间存在的交互氧化作用引起的[5]。肉中脂质的氧化反应过程复杂，其开始于动物屠宰之前，宰后随着环境的改变和内部抗氧化能力的减弱，脂质氧化程度进一步增强[6]。适度的脂质氧化可以使肉品获得良好的风味，但是大多数情况下会发生过度氧化产生不愉悦气味以及一些有毒物质如丙二醛、胆固醇氧化产物等[7]。目前通常用硫代巴比妥酸反应物值（TBARS）来反映肉品的脂质氧化程度，TBARS 值越大，肉品氧化程度越深[8]。肉品蛋白质的氧化会降低肉的保水性、嫩度、色泽和风味特性，肌肉蛋白的氧化会导致侧链氨基酸的氧化修饰，主要包括巯基氧化、芳香族羟基化和羰基的形成[9]。用总巯基的含量来表示蛋白质的氧化程度时，巯基含量越低蛋白质氧化变性程度越高[10]。此外，研究表明脂质的氧化产物如丙二醛等可与氨基酸残基共价结合，间接导致蛋白质氧化[11]，因此，脂质的氧化产物被认为是蛋白质氧化的促进剂[12]。风味是影响消费者购买肉类习惯和偏好的重要因素[13]，其受到脂质和蛋白质氧化的影响。目前关于肉品风味的研究主要集中在畜禽品种[14]、性别及年龄等[15]对其的影响上，关于贮藏时间对生鲜肉风味特性影响的研究较少。

本试验以小尾寒羊肉为研究对象，模拟最接近中国人生活习惯的贮藏方式，仅采用保鲜膜对羊肉进行包装，探究4 ℃冷藏期间羊肉蛋白和脂质的氧化及风味物质的变化情况，以期为生鲜羊肉的贮藏提供有价值的基础研究参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

同一饲养条件下6 月龄小尾寒羊的背最长肌500 g 甘肃省民勤县；普通市售PE 保鲜膜 华润万家超市；三氯乙酸 上海麦克林公司；硫代巴比妥酸、总巯基检测试剂盒 北京索莱宝生物公司；2-丁酮（2-butanone）、2-戊酮（2-pentanone）、2-己酮（2-hexanone）、2-庚 酮（2-heptanone）、2-辛 酮（2-octanone）、2-壬酮（2-nonano）等均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

BCD-460WDGZ 型冰箱 海尔股份有限公司；Mixer B-400 型均质仪 瑞士Buchi 公司；BSA224S型电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司；Vortex-Genie2 涡旋混匀器 美国Scientific Industries 公司；HH-2 型恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；SIGMA 3K 离心机 德国SIGMA 公司；UV-2550 紫外分光光度仪 岛津仪器有限公司；FlavourSpec ®型气相离子迁移谱 德国G.A.S 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集 试验羊宰前24 h 禁食禁水，经标准化屠宰后，将样品装入洁净密封袋中，迅速运至实验室，待肉冷却之后将肉样切成30 g 左右的肉块，使用保鲜膜进行分装编号后置于4 ℃冷藏室中贮藏，每天取样均质后测定蛋白和脂质氧化程度，1、3、5、7 d 测定挥发性风味物质，直至肉品腐败变质。

1.2.2 硫代巴比妥酸反应物（TBARS）值的测定 参考Wang 等[16]的方法并稍作修改，称取肉样5 g，加入10 mL 20%（W/V）的三氯乙酸（TCA）溶液，涡旋混匀，随后于3500 r/min的转速下离心15 min，过滤上清液。取5 mL 上清液，加入相同体积的0.02 mol/L的硫代巴比妥酸（TBA）溶液，将上述混合液在90 ℃水浴中孵育30～40 min，取出冷却至室温后测定532 nm波长处的吸光值（A532）。

1.2.3 巯基含量的测定 使用索莱宝生物公司提供的总巯基含量检测试剂盒测定。

1.2.4 挥发性风味物质的测定 取均质样品3.0 g 于顶空瓶中，采用自动顶空进样方式，每个样品做3 个平行。

顶空孵育温度60 ℃；孵化时间15 min；孵化转速500 r/min；进样针温度80 ℃；进样体积500 μL；不分流模式；色谱柱类型为MXT-5（15 m×0.53 mm×1 μm）；柱温60 ℃；色谱运行时间21 min，初始柱流速2 mL/min，保持2 min，8 min 内线性增至100 mL/min 并保持10 min；载气为高纯氮气（≥99.999%），漂移气流量设为固定流量150 mL/min，IMS 温度保持45 ℃。

1.3 数据统计分析

各组试验数据均重复3 次。用Excel 2007 对试验数据进行初步整理，sas 9.4 进行方差分析，origin 8.5 软件绘图。以P<0.05 作为差异显著性判断标准。挥发性风味物质的分析采用仪器自带的Laboratory Analytical Viewer（LAV）分析软件，使用GC-IMS Library Search 软件内置的NIST 和IMS数据库进行定性分析，Gallery 插件构建指纹图谱，dynamic PCA plug-ins 进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 羊肉冷藏期间TBARS 值的变化情况

脂质氧化的主要产物是过氧化物，氧化物在过氧化物酶的作用下进一步分解形成醛（丙二醛）、酮、脂肪酸等低分子量产物；形成的丙二醛可与硫代巴比妥酸反应形成粉红色，可用于脂质氧化程度的测量[17]。贮藏过程中硫代巴比妥酸值的增加与脂质氧化有关[18]。通常情况下，人们能感知到的最低酸败值为1.0 mg/kg[19]。由图1 可知，羊肉在7 d 冷藏期内TBARS 值随贮藏时间延长呈现先上升后下降再上升的趋势，发生了显著变化（P<0.05），第5 d 时达到人们能感知的酸败程度，TBARS 值为1.085 mg/kg。贮藏前5 d，TBARS 值呈显著上升趋势（P<0.05）；第6 d TBARS 值显著下降（P<0.05），TBARS 值 为0.826 mg/kg，相比于第5 d 下降了0.26%；贮藏至第7 d 时TBARS 值相对于第5 d 约增加了61.2%。黄晶晶等[20]对猪肉低温贮藏期间品质变化的研究中发现，冷藏猪肉在贮藏第5 d 时TBARS 也呈现出了下降趋势。Chouliara 等[18]使用牛至油和气调包装处理鸡胸肉发现各组的TBARS 值随贮藏时间的延长均呈现出先上升后下降或者先上升后下降再上升的趋势。李梦琪[21]对欧拉藏羊肉进行冷冻贮藏后测定TBARS 值，显示在冻藏至60 d 时，TBARS 值呈现下降趋势。分析出现该结果的原因可能是因为在冷藏前期羊肉组织结构中含有大量的小孔隙，与空气的接触面积较大，从而促进了油脂的氧化，冷藏第6 d 时，TBARS 值开始降低，可能是因为脂肪氧化产物丙二醛与羊肉中蛋白质发生了相互作用，导致丙二醛的产生速率小于与蛋白质结合速率，因此出现了下降的现象。

图1 不同贮藏时间羊肉脂质氧化程度变化趋势Fig.1 Variation trend of lipid oxidation degree of mutton at different storage time

2.2 羊肉冷藏期间巯基值的变化情况

肉品品质、加工特性及营养价值和风味、滋味受蛋白质氧化的影响极大。评判蛋白质氧化的指标主要为羰基衍生物的产生量、巯基值的损失及蛋白交联物的形成[21−22]，该试验以总巯基值的损失来评价蛋白质的氧化程度。肉类蛋白中半胱氨酸残基中的硫醇基团极易被任何形式的活性氧（ROS）氧化，转化为二硫键和其他硫醇氧化产物，如磺酸、亚砜及硫代亚磺酸盐等[23]。由图2 可知，在整个冷藏期间，肌原纤维蛋白总巯基含量呈现先下降后上升的趋势。在贮藏期的前4 d 巯基含量呈现显著下降趋势（P<0.05），在第4 d 之后呈现显著上升趋势（P<0.05）。冷藏第1 d的巯基含量为1.78 μmol/g，第4 d 时巯基含量为1.03 μmol/g，巯基含量损失约0.75 μmol/g；第7 d 时巯基含量为1.45 μmol/g，相比于第4 d 约增加了0.42 μmol/g，相比于第1 d 损失了约0.33 μmol/g。贮藏前期，巯基含量显著减少可能是由肌球蛋白的降解导致巯基暴露出来被氧化所引起的[24]；第4 d 之后，总巯基含量呈上升趋势，这与卢骁等[25]的研究结果不一致，分析导致巯基含量增加的原因可能与脂类氧化衍生物含量的降低有关[26]，其次还可能与活性氧的含量有关。

图2 不同贮藏时间羊肉蛋白质氧化程度变化趋势Fig.2 Variation trend of protein oxidation degree of mutton at different storage time

2.3 羊肉冷藏期间挥发性风味物质的变化分析

2.3.1 羊肉挥发性化合物的定性 挥发性化合物的定性是根据该物质在色谱柱中的离子迁移时间和保留指数与仪器内置的NIST 和IMS 数据库比对进行鉴别的，部分化合物会产生二聚体甚至三聚体，它们的保留时间相近，迁移时间不同[27]。

表1 列出了整个冷藏期间所鉴定出的挥发性化合物组分，包括化合物名称、CAS 号、保留指数、保留时间和迁移时间。由表1 可知，从冷藏羊肉中共鉴别出了31 种挥发性化合物，分别为醇、酯、烃、酮、醛、酚、醚、吡嗪及含硫化合物9 大类，还有5 种化合物未定性出来。在整个贮藏过程中，羊肉中的挥发性化合物主要为酮类，其次为醛类和醇类；没有发现辛酸、己酸等膻味物质。2-庚酮、2-戊酮、3-羟基-2-丁酮、乙醇、叔丁醇、正己醛、3-甲硫基丙醛、苯甲醛出现了二聚体，其在离子迁移光谱图和指纹图谱中表现为双峰。

表1 冷藏羊肉中挥发性化合物的定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile compounds in refrigerationmutton

冷藏期间未检测出烷烃类物质。IMS的本质是检测挥发性化合物和水合质子形成的质子化单体，由于样品的顶空气体和载气中含有水蒸气，导致漂移管电离区烷烃的电荷很难得到，因此，GC-IMS 光谱在定性检测结果中显示烷烃很少或者没有[28]。

2.3.2 不同贮藏时间羊肉挥发性成分的指纹图谱分析 在GC-IMS的指纹图谱中，特征峰的颜色越深，表明其该物质含量越高。由图3 结合表可知，不同贮藏时间样品的成分之间有较大差异，第7 d 时挥发性化合物种类最多。其中乙酸己酯、异丁香酚、愈创木酚在羊肉冷藏期间含量变化不大，这三种物质分别具有水果清甜的气味、柔和清甜的辛香味及一种特殊的芳香气味。叔丁醇（A 区域）在贮藏第1 d 含量最高，叔丁醇具有樟脑气味，其随贮藏时间的延长逐渐降低。

图3 不同贮藏时间冷藏羊肉挥发性物质指纹图谱Fig.3 Fingerprints of volatile substances of refrigeration mutton at different storage times

庚醛、正辛醛、正己醛（B 区域）在第3 d的含量较高，它们分别具有油脂、青草及水果香味，是构成羊肉香味的主要物质[29]。醛类物质主要来源于原料肉中不饱和脂肪酸的氧化和糖降解，低分子量的醛通常产生难闻的气味，高分子量的醛具有类似水果味的香甜味，醛类物质不稳定，很容易与其他化合物发生反应，产生不同风味的化合物[30−31]。

贮藏至第5 d 时出现3-羟基-2-丁酮和2-庚酮（C 区域），这两种化合物呈现出令人愉悦的奶香气；3-羟基-2-丁酮又名乙偶姻，其是美拉德反应的产物，可能来源于油酸氧化或者葡萄糖的分解[32]，对肉品的香味的形成起着非常重要的作用[33]。Casaburi等[34−35]报告称肉样品中出现具有乳脂味，奶酪味的相关酮类物质可以归因于微生物密度和多样性的增加，因此，这两种化合物的出现可能是微生物的作用引起的。

二甲基二硫、2-甲基丁醇、异丁醛、异戊醛以及未定性出的化合物2、3（D 区域）均仅出现在第7 d，其中二甲基二硫是一种有恶臭味的物质；异丁醛具有强烈的刺激性气味；异戊醛具有酸败味，有强烈的令人恶心的气息可能与羊肉的膻味有关[36]。

2.3.3 主成分分析 根据不同贮藏时间羊肉挥发性风味物质的离子迁移指纹图谱，采用仪器自带Dynamic PCA plug-ins 软件进行主成分分析处理。结果如图4 所示，第一主成分的贡献率为79%，第二主成分的贡献率为10%，第三主成分的贡献率为5%，三个主成分的累计贡献率超过90%，分析所得数据能够反映不同贮藏时间羊肉挥发性成分变化的总体特征。四个贮藏时间点的样品分布在不同的区域，且各个点比较集中，表明不同贮藏时间挥发性物质存在明显差异。主成分分析结果表明，气相离子迁移谱能够根据风味物质的变化情况判别和区分不同贮藏时间的羊肉。

图4 不同贮藏时间羊肉PCA 分析图Fig.4 PCA analysis of mutton at different storage times

3 讨论与结论

本研究利用化学方法分析了羊肉冷藏期间蛋白质和脂质的氧化情况，结果表明随着贮藏时间的延长蛋白质和脂质氧化程度逐步加深，并发现第5 d 是脂质和蛋白质氧化的转折点，证明了脂质的氧化程度和蛋白质的氧化呈现出相关性。利用GC-IMS 技术分析了冷藏期间羊肉中挥发性风味物质的变化，冷藏期间共检测出39 种化合物，鉴别出31 种。其中第1 d 挥发性物质的种类较少，庚醛、正辛醛、正己醛等羊肉的主要香味物质第3 d 时含量最高，第5 d 出现了由微生物数量增多引起的3-羟基-2-丁酮和2-庚酮，第7 d 挥发性物质种类最多，出现了导致羊肉酸败腐臭的二甲基二硫和和异丁醛等物质；且以上特征挥发性化合物的出现与脂质和蛋白质的氧化也呈现出相关性。参考前人的研究思路[37−38]，进一步对数据进行多元统计分析，证明PCA 能基于挥发性成分的变化对不同贮藏时间的羊肉进行有效区分。

后续的研究有必要缩短检测时间段，找出肉品品质最佳的时间点，以及对脂质和蛋白质氧化与挥发性风味物质变化的具体机理进行探究；除此之外，需要进一步完善IMS 数据库，扩展GC-IMS 分析技术在肉品风味领域的研究。