生物散斑激光技术无损检测原理及在食品中应用效果研究进展

冯 佳，李新宇，杨欣悦，李 莹，赵梦娜，任 静，夏秀芳

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

新鲜果蔬和肉是人体健康所必需的主要营养来源。但是新鲜农、畜产品极易腐烂，货架期短，且在装卸、运输和加工过程中非常容易变质，这严重损害了消费者的经济利益和健康。因此，对农、畜产品进行质量检测极为重要。食品无损检测是指在不伤害或不影响食品食用性能的前提下,利用光、声、电、磁和力等原理对食品进行缺陷、化学和物理参数的测定[1]。因其具有传统检测技术无法比拟的非破坏性、可对同一样品进行多次重复检测等优势，其在食品质量与安全检测中的应用日渐广泛[2]。

由于无损检测具有传统检测技术无法比拟的优势，其在食品质量与安全检测中的应用日渐广泛。其中基于光学的无损检测技术主要是通过食品对光的反射、吸收以及散射等特性实现对食品品质的检测，包括机器视觉[3]、近红外光谱[4]、高光谱成像[5]和生物散斑激光技术等。这些技术已被广泛应用于食品检测中，使得食品质量与安全检测得到了质的提升[6]。机器视觉是从外观特征对样品进行定性判别，而无法反映其内部信息[7]；近红外和高光谱技术可实现样品某些指标的定量分析，但设备成本较高，且近红外技术模型建立要以大量化学测定为基础、分析结果的准确性易受外界因素影响，高光谱技术在数据处理量、检测分析速度方面仍然有待改进[8]。生物散斑激光技术基于相干光照射在活性材料表面形成的动态散斑来获取生物信息，从而实现对样品的分析和检测[9]，相比于上述技术，生物散斑激光技术不仅可以达到相同的检测效果，同时还具有对样品破坏性小、成本更低、可快速检测、同时实现对样品的实时在线定性及定量分析并且能够反映样品外部品质、营养成分及内部品质的诸多优势，在食品质量与安全检测中具有极强的市场竞争力。

本文介绍了生物散斑激光技术的基本原理，并对该技术在农、畜产品无损检测中应用的研究进展进行了综述，总结了其在食品质量与安全检测中的优势及缺陷，旨在为生物散斑激光技术在农、畜产品方面的广泛应用提供理论参考。

1 生物散斑激光技术

1.1 生物散斑激光技术基本原理

生物散斑激光技术是基于对激光照射生物材料产生的散射光的研究过程[10]（图1）。当激光照向生物材料时，经过包括空气空间、皮肤、纤维、细胞壁在内的一层或者多层组织的散射，最终在观测平面形成由亮斑和暗斑组成的随机颗粒状图案[11]。其中亮斑是粒子散射光以同一相位到达屏幕相互叠加形成的可变图案，被称为生物散斑[12]。生物散斑可以反映食品所处的状态，它的变化与食品内部物理和化学成分在时间和空间上的不稳定性及其内部组织结构的不均匀性有关[9]。

图1 生物散斑激光技术原理图[13-18]Fig.1 Schematic diagram of biospeckle laser technique[13-18]

1.1.1 物理特性 从物理上来讲，生物散斑活性与生物材料成熟和生化反应过程中的细胞质流、细胞器运动、细胞生长和分裂有关[19]：细胞器和随水流运动的溶解大分子是散射中心，可以引起动态光散射；根据酸生长理论的研究，在生长过程中，果蔬纤维素分解酶的排泄使细胞壁松弛，膨胀压力增加，这可能是动态光散射的直接来源，另一方面，农产品成熟或损伤过程中伴随着细胞壁降解的化学变化，导致组织的光谱特性朝着更大的光吸收方向变化，这可能会减少扩散反射光的数量，从而降低生物散斑动力学[20]。此外，布朗运动也应该被认为是生物散斑活动的来源[21]。

1.1.2 化学成分 在果蔬中，生物散斑的表观活性是细胞内粒子物理运动的结果，并受组织色素对光吸收变化的影响[22]。生物散斑的研究通常采用红色激光，这一光波可被叶绿素吸收，因此含有叶绿素的物质其光传播和生物散斑活性都会受到影响。果蔬在成熟过程中生物散斑活性的增强与其体内叶绿素的降解有关[23]：叶绿素的降解会导致光吸收率降低，进一步导致激光穿透更深，照明光斑尺寸增加，照明体积增大，散斑颗粒尺寸变小，粒子运动加快，散射光斑强度快速波动；另一方面，生物材料内部散射粒子数量增加，生物散斑活性增强。还有研究表明，样品生物散斑活性的大小还与类胡萝卜素含量有关[24]。此外，Zdunek 等[25]还研究发现，果蔬的生物散斑活性与淀粉含量呈显著正相关（R=0.849），这是由于在果实成熟过程中淀粉降解为碳水化合物，可溶性固形物含量（Soluble solid content，SSC）增加，组织内散射粒子数量增加所致。

肉在冷藏过程中，随着时间的变化，由于酶解及微生物的作用，蛋白质大分子降解为氨和胺类化合物等小分子碱性含氮物质，即挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的含量上升[26]，也会引起组织散射中心散射粒子粒径及数量的变化，进而引起散斑活性改变。

1.1.3 内部组织结构 光散射特性与微生物运动有关,微生物运动速度越快，生物散斑活性越高[20]，可以以此来检测果蔬内部微生物感染情况。在肉组织中，光散射会发生在其内部肌纤维、结缔组织与脂肪组织及周围间质粒子之间折射率不连续的边界上，而这些组织的分布情况、分布数量等正是影响肉嫩度的最重要的因素[27]，因此，光散射特性可以作为肉嫩度检测的潜在指标。此外，Isis 等[28]研究发现，生物散斑活性与肉的颜色也有很强的相关性，这可能与肉色变化引起的光吸收率的改变有关。

1.2 生物散斑激光技术测量

1.2.1 生物散斑激光技术测量过程 生物散斑激光技术测量装置较其他检测成像设备简单，其基本设备通常包括激光器、扩束-准直系统、接收图像的电感耦合器件（charge coupled device，CCD）、进行图像处理的PC 等[29]。依据扩束-准直系统的不同，生物散斑激光技术常用测量装置有三种（图2）[30]。

图2 生物散斑激光技术装备示意图[30]Fig.2 Schematic diagram of biospeckle laser technique equipment[30]

1.2.2 数据处理方法 传输到PC的原始散斑图像经过相应图像化或者数字化处理可以实现对样品的定性及定量分析[31]（图1）。生物散斑激光技术常用的图像化处理方法包括Fujii、GD、THSP、COM，其中Fujii 和GD 是通过处理后散斑图像上颜色的不同来区分不同活性区域或者不同活性样本，THSP 通过散斑图案的平稳程度来衡量散斑活性的大小，COM 通过非零值在主对角线的扩散程度来定性分析散斑活性；IM、AVD、相关系数是常用的数字化处理方法，通过一定的数字化处理将生物活性量化。

2 生物散斑激光技术在农、畜产品质量和安全检测方面的应用

近年来，生物散斑激光技术在农、畜产品质量与安全检测方面的应用已经较为广泛，主要表现在农、畜产品成熟度监测、新鲜度监测以及品质检测中。

2.1 生物散斑激光技术在农、畜产品成熟度监测中的应用

2.1.1 在水果成熟度监测中的应用 生物散斑激光技术可以通过对SSC、硬度、淀粉含量（starch content，SC）等的无损评价来确定水果成熟度，进一步预测水果最佳采收期。Szymanska-Chargot 等[32]分别采用生物散斑激光技术和常用理化检验对样品进行分析，结果发现苹果在成熟过程中生物散斑活性值（biospeckle activity，BA）和SSC（R=0.91）、SC（R=−0.80）及硬度（R=−0.89）均有很强的相关性。在此基础上，Anna 等[33]还进一步发现BA 与Streif 指数及苹果内部发生的生理变化均有良好匹配。除此之外，对水果采前成熟度的预测在芒果[34]、macaw palm 果实[35]、香蕉[36]上也得到了证实。

生物散斑激光技术也可通过生物散斑活性与贮藏时间的相关性用于水果采后阶段成熟度的无损评价，预测水果货架期。Ansari 等[22]先后对苹果、梨[22]及柠檬[37]进行了研究，研究指出，这几种水果的生物散斑活性在果实的不同成熟阶段均有所不同，由此可以确定果实的生理年龄，预测其货架期。

2.1.2 在蔬菜成熟度监测中的应用 生物散斑激光技术可以通过对硬度、叶绿素含量、类胡萝卜素含量的无损评价来预测蔬菜成熟度。Romero 等[38]揭示了番茄在成熟过程中叶绿素的降解与散斑活性变化和散射光强度变化之间的关系。Piotr 等[24]指出，在640 nm 激光波长下，“starbuck”品种番茄的生物散斑活性（特征值ε）与番茄硬度（R2=0.93）、叶绿素（R2=0.91）和类胡萝卜素含量（R2=0.85）显著相关；实验还通过标准光学测量（色度C*、红度值a*/黄度值b*和亮度L*）验证了生物散斑成像的性能。

2.1.3 在肉成熟度监测中的应用 肌肉在成熟过程中发生的肌肉纤维断裂、肌节减少、细胞核变形、核染色质减少、线粒体破坏等一系列生化变化会导致其生物散斑活性水平的降低。Maksymenko 等[39]研究表明，肌肉在屠宰之后发生这一系列生化变化会导致冷冻肌肉CBAM（coefficient of biospeckle activity，CBA）的单调下降。

生物散斑激光技术还可以通过表征肉的嫩度、颜色等外部品质的变化来评价和预测肉品质量。Isis 等[28]研究表明，牛肉在成熟过程中AVD 值与Warner-Bratzler 剪切力(Warner–Bratzler Shear Force，WBSF)（R=0.615）、h*（R=0.795）、a*（R=0.812）、b*（R=0.912）均有较强相关性。董庆利等[40]也得到了相同的结果：IM 对牛肉硬度、咀嚼性及WBSF的预测决定系数分别为0.83、0.77 和0.69。

2.2 生物散斑激光技术在农、畜产品新鲜度监测中的应用

采用生物散斑激光技术，可以通过IM 值预测蛋白质分解、水分含量及肉色变化等多种生化变化来监测肉的新鲜度。肉新鲜度的传统测量方法为半微量定氮法，采用这种方法测量肉制品中TVB-N的含量，据此对猪肉的新鲜度进行等级划分。采用生物散斑激光技术可以实现对肉新鲜度更加快速、方便、准确的无损测量。刘梦雷等[41]发现：在465 nm 激光波长下，肉的新鲜程度与散斑活性有关；依据肉类新鲜度等级划分标准，采用线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）对测得的TVB-N 值和散斑活性IM 值建立猪肉新鲜度等级预测模型得到的训练集和预测集识别率均高于87%，其中IM 值对不新鲜猪肉的识别效果更好，其训练集识别率达到了100%。之后，他们还进一步探究发现生物散斑活性与猪肉中水分含量及肉色之间也有很强的相关性。

2.3 生物散斑激光技术在农、畜产品品质检测中的应用

2.3.1 化学残留物检测 因为蔬菜腐烂速度快，保质期短，因此蔬菜的保存是一直以来的研究热点。在蔬菜中添加化学杀虫剂和人工防腐剂，可以有效延长其货架期和成熟期，但是这些物质的添加会极大降低蔬菜的质量，表现为动态散斑活性的降低。Samuel 等[42]研究发现：相比于正常样品，浸泡过化学杀虫剂的黄瓜样品，虽然货架期和保质期延长，但其品质下降，动态散斑活性降低了15%。

2.3.2 掺假检测 掺假也是食品工业面临的重要挑战，生物散斑激光技术可以克服现有食品掺假检测技术耗时耗力、灵敏度低的缺点，用于食品的无损定量分析。贾桂锋等[43]将新鲜牛肉和非新鲜牛肉按不同梯度比例混合制备掺假样本并测量其生物散斑活性，结果发现IM 谱中高平峰区的左侧结束点随着掺假浓度的升高向右侧移动，即掺假浓度越高散斑活性越低，且基于IM 谱建立的支持向量回归机（support vector regression machine，SVR）校正集和测试集的决定系数均高于0.81，均方根误差分别为0.12 和0.11，效果良好。

2.3.3 损害监测 水果在成熟过程中受环境条件影响可能会发生损害，利用生物散斑激光技术可以通过活性图或者活性值的改变分辨正常水果和受损水果甚至对不同损伤程度的水果进行分类。Rahmanian 等[44]模拟了不同条件下的柑橘，结果发现，相对于正常柑橘，冷却条件下柑橘的生物散斑活性较高，冷冻条件下柑橘的活性水平较低，其中极端冷冻条件下柑橘组织细胞死亡，活性水平接近于零，采用Fujii 获得的活性图也表现出相同的结果；此外，依据COM 中提取的变量运用人工神经网络分类模型（artificial neural networks，ANN）对四种柑橘进行分类得到的准确率达到100%，这可为实现柑橘自动分级提供理论依据。

蔬菜和水果的柔软表皮在收获和收获后的操作中容易受损，其表面的机械损伤是微生物入侵的重要港口，会导致产品质量下降，不仅如此，受损产品还会进一步导致其他产品的快速腐烂，危及食品安全，因此，对这类果蔬的正确鉴别具有重要意义。发生机械损伤的果蔬生物散斑活性会改变，Pajuelo 等[45]初步研究发现，苹果在钢球撞击前后相应自相关函数的累积量在t检验中存在显著性差异（P<0.001）。Samuel等[42]进一步研究指出，正常苹果和由于外力受损苹果的互相关百分比相差约25%～30%，橙子在受到应力后，相关性增加，且互相关值与水果的受损程度呈负相关；采用GD 法可以将正常水果和受损水果之间的散斑活性差异变得可视化。Anderson 等[46]发现：AVD 值与马铃薯淤伤所导致的渐变性褐变有显著相关性（r=−0.79），区域暗度的增加及外力影响与生物散斑活性的下降有关，且在机械撞击发生4 h 后即可检测到其内部瘀伤。

生物散斑激光技术可以通过生物散斑活性与水果贮藏状态的相关性实现对不同状态水果的定量无损分析。水果在贮藏过程中根据其质地柔软程度及多汁性可以分为新鲜水果、半粉水果和粉水果。Arefi 等[47]发现，新鲜苹果的IM 值和AVD 值均显著高于半粉苹果和粉苹果（P<0.05），依据传统粉水果测量（限制性压缩实验）分类方法，采用AVD 值对三种品质的苹果进行分类准确率高于70%。之后，他们进一步研究发现，基于THSP 中提取出来的图像纹理特征的ANN 对新鲜和粉苹果的分类准确率又有所提升，均高于86%[48]。

2.3.4 微生物感染检测 感染了活性真菌和细菌的食品，其贮藏和贮藏后品质会急剧降低，生物散斑活性相对健康食品较高。Pieczywek 等[49]及Adamiak等[50]研究表明：假单胞菌接种后三天，健康组织和感染组织散斑活性相差约40%；Fujii 和互相关法均能够在接种后的第一天检测到苹果中牛眼腐病的感染，这比叶绿素荧光方法提前一天，而仅凭肉眼观察在接种后第四天才能观察到苹果表面真菌的生长，极大地提高了检测效率，并且相比于高光谱技术，其谱图也更为清晰。以上研究结果表明，生物散斑激光技术在食品微生物感染检测中应用效果较好。

3 生物散斑激光技术特点

生物散斑激光技术作为一种新兴的食品质量与安全检测技术，具有无损、检测效率高、应用范围广等优势，但同时也存在稳定性差、穿透深度浅等缺陷。

3.1 无损

生物散斑激光技术的主要优点是不用探头接触样品，可以在不破坏其物理完整性的情况下对样品进行检查[51]。另一方面，该技术所使用的激光器通常为低功率He-Ne 激光器，功率为mW 级别，光斑直径范围为1 mm～10 cm[20]，辐照强度为每平方厘米仅为毫瓦级，属于低强度激光/弱激光，这种激光常在生物医学中用来做生理刺激源[52]，不会对研究样品直接产生不可逆损伤。

3.2 检测效率高

在检测过程中，生物散斑激光技术通过相机曝光来获得散斑视频序列，依据相机捕获速度的不同，10 s 即可获得包括300～600 张散斑图像在内的8 位视频序列；生物散斑激光技术还可以在外部损伤不可视的情况下即检测到由其引发的生物活性的改变[31]，以便快速了解样品所处的状态，检测效率大大提高。即使是在检测完成后，生物散斑激光技术所需要的数据测量及后处理耗时也相对较少。

3.3 应用范围广

生物散斑激光技术可以通过对初始散斑图像进行图像化或者数字化分析，实现对样品的实时在线定性、定量无损监测；在检测过程中可以与多个指标建立相关性，这可能可以从多维度评价食品的一个或者多个特性，从而实现对食品综合品质的评价，满足更大的检测需求。

3.4 稳定性差

采用生物散斑激光技术进行分析时，容易受到光线以及噪声的干扰。光线的干扰可以通过在黑暗环境下实验解决，而噪声问题可以通过快速测量的方法解决，即只使用一幅图像或一小组图像，也可结合滤波的方法进一步抑制噪声的产生，以得到更加清晰、细节更加丰富的散斑图[53]。

3.5 穿透深度浅

激光对样品的穿透能力一定程度上也限制了它的应用。例如，He-Ne 激光在苹果皮中的穿透深度只有2 mm[54]，在苹果组织中只有7～10 mm[55]。在果实的中心部位很难获得生物散斑活性，并且农产品的表面特性也会影响生物散斑活性，因此可能会对实验结果造成一定的影响。

4 结语与展望

生物散斑激光技术具有低成本、非接触、可应用于多种固态食品等诸多优势，是食品质量监控和安全检测的有效工具。目前，对该技术的研究虽然已经取得较大进展，但在食品领域应用方面却仍处于基础研究阶段，在今后的开发、利用中，还有许多问题亟待解决：

生物散斑激光技术在农、畜产品中的应用已经得到了较为广泛的研究，但各指标与生物活性之间相关性的机理还未能得到深入揭示，可进行深入研究；同时还可以通过机理的揭示进一步发现生物活性与更多指标之间的相关性，从而进一步拓宽生物散斑激光技术在食品无损检测中的应用范围。

目前生物散斑激光技术检测范围还较为局限，之后可将生物散斑激光技术与其他无损检测技术如近红外光谱、机器视觉技术等有机结合，充分利用多元信息，使食品质量得到更加简单、快速、准确、全面的评价。

生物散斑激光技术在农、畜产品中的应用目前还局限于实验室阶段，之后可以开发便携装置，通过建立数据库，实现对食品的快速、无损检测。