尿激酶原联合瑞舒伐他汀对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡及梗死面积的影响

赵晓宁，刘志远，刘江波，李 纲，张松雨，张金盈

(1.南阳市中心医院 心血管内科，河南 南阳473009；2.郑州大学第一附属医院 心血管内科，河南 郑州450052)

急性心肌梗死(AMI)是由于冠状动脉供血不足引起的心肌缺血缺氧性疾病，在欧美国家具有较高的发病率，近年来我国AMI也呈现出逐渐升高的趋势[1-2]。瑞舒伐他汀(RSV)目前常用于高脂血症、冠心病等疾病预防，还具有降血脂、抗炎、抗氧化以及免疫调节等作用[3]。已有研究表明RSV可以降低AMI细胞凋亡，改善AMI心室重塑以及心功能损害作用。尿激酶原(pro-UK)对纤维蛋白纤溶酶原具有激活作用，具有溶栓功能，与传统的溶栓药物相比具有不良反应小、疗效显著等优点[4-5]。目前pro-UK联合RSV对AMI心肌影响的相关报道较少，本研究通过制备AMI大鼠模型，探索pro-UK联合RSV对其心肌组织可能存在的影响，希望能为AMI药物治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与动物

1.1.1实验动物 SD大鼠，雄性，60只，4-5周龄，体质量(250±20)g，无特定病原体(SPF)级别，购自南方医科大学【许可证号，SCXK(粤)2016-0041】，在SPF级饲养标准饲养，购回后适应性饲养1周，符合动物3R标准。

1.1.2主要试剂及仪器 Bcl相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、cleaved-Caspase-3抗体(上海恒斐生物科技有限公司)，瑞舒伐他汀(阿斯利康生物制药有限公司)，尿激酶原(上海熹垣生物科技有限公司)，氯化三苯硝基四氮唑红(TTC)(上海源叶生物科技有限公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)ELISA试剂盒(上海远慕生物科技有限公司)，肿瘤坏死因子-ɑ(TNF-ɑ) ELISA试剂盒(上海恪敏生物科技有限公司)。冷冻离心机(EXPERT 15K-R，湖南吉尔森科技发展有限公司)，石蜡切片机(HM325，英国赛默飞公司)，显微镜(XDS-800C，上海蔡康光学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1分组及模型制备 将60只SD大鼠按体重随机均分为假手术组、模型组、RSV组、RSV+尿激酶原组，其中模型组、RSV组、RSV+尿激酶原组用于AMI模型制备，参考文献[6]运用结扎左冠动脉前降支方法制备AMI模型，并且各组大鼠在术后腹腔注射40万单位青霉素，连续5 d，预防术后感染，假手术组大鼠只进行至穿线步骤但不进行结扎。RSV组、RSV+尿激酶原组术后次日灌胃RSV，剂量为1 mg/(kg·d)；RSV+尿激酶原组增加尿激酶原干预，首次进行静脉注射尿激酶原1 mg/kg，之后静脉注射0.25 mg/(kg·d)，一周一次，假手术组、模型组大鼠均灌胃相同体积生理盐水，连续干预4周。

1.2.2样品采集 末次干预结束后24 h，然后再对各组大鼠的血流动力学进行检测，检测完成后，再将各组大鼠麻醉处死，迅速取出完整的心脏组织，分别用于心肌梗死、心肌组织HE染色、TUNEL凋亡、心肌组织氧化应激及炎性因子水平以及Western blot检测。

1.2.3血流动力学检测 将导管经右颈总动脉插入左心室，记录各组大鼠的平均动脉压(MAP)，左心室的收缩压(LVSP)、舒张末压(LVEDP)、内压下降的最大速率(LV-dp/dtmax)、内压上升的最大速率(LV+dp/dtmax)。

1.2.4TTC/Evans blue检测 将取出心脏置于预冷4℃生理盐水中洗涤，洗净血液，并向左心室中灌入Evans blue溶液2 mL、染色2 h，其中未染色区即为狭窄冠脉支配的缺血区，灌入2%琼脂于4℃冷却至凝固，并将心肌组织切成3 mm厚切片，2%TTC染色20 min，其中鲜红色区域为未发生的坏死区域，未着色区为坏死区域，采用4%多聚甲醛固定24 h，然后采用Image J对心肌组织梗死区域、缺血危险区的面积进行计算。

1.2.5HE染色 4%多聚甲醛中固定心肌组织，常规石蜡包埋，切成4 μm，苏木精、伊红染色，中性树胶封片，观察心肌组织病理变化[7]。重复3次。

1.2.6氧化应激及炎性因子水平检测 取0.5 g心肌组织，加入组织细胞裂解液、蛋白酶抑制剂，研磨成组织匀浆，3 000 r/min，离心20 min，取上清液，采用ELISA检测心肌组织中MDA、SOD、IL-6、TNF-ɑ水平。重复3次。

1.2.7TUNEL检测心肌组织凋亡 常规石蜡包埋、切片、脱蜡，蛋白酶K修复20 min，3 % H2O2室温5 min，PBS洗2次，TdT酶于37 ℃反应60 min，PBS洗3次，氧化物酶标记的链酶卵白素工作溶液反应30 min，PBS洗4次，0.05% DAB显色4 min，蒸馏水洗4次，苏木精复染10 min，蒸馏水洗3次，脱水，透明，封片。每张片子选取5个视野，记录阳性细胞数，取其均数作为该组阳性细胞数，阳性细胞表现为核黄色或者棕褐色颗粒。重复3次。

1.2.8Western blot检测 取0.5 g心肌组织，蛋白提取试剂盒对各组大鼠心肌组织的总蛋白进行提取，Bradford蛋白定量，SDS-PAGE分离，将30 μg蛋白转移至PVDF膜、室温密封2 h，洗膜并加一抗(Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3、GAPDH，1∶500)4℃孵育过夜，TBST缓冲液漂洗40 min，然后加入HRP标记二抗(1∶500)，37℃孵育2 h，ECL显色，收集条带影像。重复3次。

1.3 统计学方法处理实验数据采用平均值±标准差的形式表示，one-way ANOVA检验组间差异有统计学意义时，两两组间的差异比较用LSD-t检验，SPSS 22.0软件，检验水平ɑ=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠的血流动力学变化与假手术组相比，模型组的MAP、LVSP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax均降低(P<0.05)，LVEDP升高(P<0.05)；与模型组相比，RSV组、RSV+尿激酶原组的MAP、LVSP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax均升高(P<0.05)，LVEDP降低(P<0.05)；RSV组、RSV+尿激酶原组的MAP、LVSP、LVEDP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax比较差异不显著(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠的血流动力学变化

2.2 pro-UK联合RSV对AMI大鼠心肌梗死及病理结构的影响假手术组大鼠的心肌组织细胞排列整齐、细胞结构完整、未出现明显的病理变化，模型组大鼠心肌细胞出现炎性浸润、坏死以及排列不规则，RSV组、RSV+尿激酶原组心肌细胞排列情况、细胞损伤情况、炎性浸润较模型组明显减轻，病理情况得到改善，见图1。与模型组相比，RSV组、RSV+尿激酶原组大鼠心肌组织相对梗死面积均降低(P<0.05)；RSV+尿激酶原组大鼠心肌组织相对梗死面积低于RSV组(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠的心肌相对梗死面积比较

图1 各组大鼠心肌组织病理变化(×200)

2.3 pro-UK联合RSV对AMI大鼠心肌氧化应激与炎性因子水平的影响与假手术组相比，模型组的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平均升高(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；与模型组相比，RSV组、RSV+尿激酶原组的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平均降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)；与RSV组相比，RSV+尿激酶原组的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平降低(P<0.05)，SOD活性升高(P<0.05)。见表3。

表3 pro-UK联合RSV对AMI大鼠心肌氧化应激与炎性因子水平的影响

2.4 pro-UK联合RSV对AMI大鼠心肌组织凋亡的影响TUNEL检测结果显示，与模型组相比，RSV组、RSV+尿激酶原组大鼠心肌组织凋亡率均降低(P<0.05)；RSV+尿激酶原组大鼠心肌组织凋亡低于RSV组(P<0.05)，见图2、表4。与假手术组相比，模型组Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)；与模型组相比，RSV组、RSV+尿激酶原组大鼠心肌组织中的Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)；与RSV组相比，RSV+尿激酶原组大鼠心肌组织中的Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，见图3、表5。

图2 各组大鼠心肌组织TUNEL检测结果(×200)

图3 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3凝胶成像结果(×200)

表4 各组大鼠的心肌细胞凋亡率比较

表5 各组大鼠心肌组织Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3水平比较

3 讨论

AMI是临床缺血性疾病死亡原因之一，不但给患者带来心理压力，而且还会增加收治患者的经济压力[8-9]。RSV是一种具有调脂、非调脂作用的他汀类新型药物，非调脂作用主要体现抗氧化、抗炎、抗心肌细胞肥大以及调控细胞凋亡、血管内皮细胞功能，能够抑制AMI后的心室重构并且改善心室功能[10-11]。尿激酶原属于丝氨酸蛋白酶类，分子约为49 kD，具有4个酶切位点，其本身的活性较低且在血浆中只有微弱活性，当到达血栓后，经纤溶酶激活后，部分可转化为双链UK，部分因结合在血栓表面致其构型发生改变转化为纤溶酶，促进血栓纤维蛋白溶解[12-13]。本研究结果显示，AMI大鼠的血流动力存在MAP、LVSP、LV-dp/dtmax、LV+dp/dtmax明显升高趋势，而LVEDP呈现出明显降低趋势，舒伐他汀、尿激酶原联合RSV干预后可以明显改善AMI大鼠的血流动力学情况。Yao等[14]认为重组尿激酶原对PPCI术后冠状动脉血流的改善效果明显，其疗法与替罗非班具有相似安全性。由此推测，尿激酶原联合RSV可以改善AMI大鼠的血流动力学情况。

AMI发生机制最早有血栓学说、炎症学说、脂质浸润及氧化应激学说等，由此表明AMI的发病机制较复杂[15-16]。本研究结果发现AMI模型组大鼠的心肌梗死面积增加，并且心肌组织细胞排列紊乱，细胞损伤严重，由此表明AMI大鼠心肌组织存在严重损伤。经RSV、尿激酶原联合RSV干预后，AMI大鼠的心肌梗死面积降低，心肌组织细胞病理情况得到改善，并且尿激酶原联合RSV干预后的改善情况更显著。由此推测，尿激酶原联合RSV对AMI大鼠心肌组织的改善作用可能与影响炎症反应、氧化应激反应有关。本研究结果显示AMI大鼠心肌组织中的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平升高，SOD活性降低，而RSV、尿激酶原联合RSV干预后，心肌组织中的MDA、IL-6、TNF-ɑ水平降低，SOD活性升高。MDA是脂质氧化产物，SOD可以清除自由基，单核细胞、成纤维细胞可合成分泌IL-6、TNF-ɑ，IL-6可诱导产生TNF-ɑ，加重机体炎症反应。TNF-ɑ可以在衰竭心肌组织中表达，并且与临床血流动力严重程度有关，TNF-ɑ高表达会促进心肌肥大、心室重塑以及心肌细胞凋亡[17]。已有研究[18]表明，RSV可以通过抑制IL-6、TNF-ɑ等炎性介质的释放，从而降低AMI大鼠的心肌纤维程度，进而改善AMI大鼠的心室功能。有研究[19]显示重组人尿激酶原联合RSV可以降低AMI患者PCI术后炎性因子水平，改善患者预后。由此表明，尿激酶原联合RSV可以调节AMI大鼠心肌组织氧化应激及炎性反应，但其作用机制还需要深入研究。

AMI可以引起心肌组织出现功能障碍，激活体内的神经内分泌系统，引起内源性的氧化物质水平增加，诱导体内凋亡途径活化，从而促进心肌细胞发生凋亡、坏死。本研究结果显示，模型组大鼠心肌细胞凋亡率显著高于假手术组，而且心肌组织中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平检测结果也表明模型组大鼠心肌组织中的Bcl-2蛋白水平降低，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平升高，由此表明AMI大鼠存在心肌组织凋亡损伤。RSV、尿激酶原联合RSV干预之后，发现AMI大鼠的心肌细胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白水平升高，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平降低。Bcl-2、Bax是Bcl-2家族中与细胞凋亡相关的重要成员，两者结合后可形成异构二聚体或者是共同调节胞内钙离子含量，参与细胞凋亡的调控作用[20-21]。Caspase-3位于凋亡级联反应下游，是细胞凋亡通路的最终执行者[22]。RSV可以有效抑制AMI大鼠的心肌细胞凋亡[23]，由此推测其作用机制可能与调节基因caspase-3表达量有关。

综上所述，本文通过大鼠模型实验证实RSV、尿激酶原联合RSV均对AMI大鼠的心肌梗死面积、心肌组织凋亡情况、以及血流动力学具有改善作用，并且尿激酶原联合RSV在心肌梗死面积、心肌组织凋亡方面的改善作用更显著。本文的研究结果只表明尿激酶原联合RSV对AMI大鼠心肌损伤有改善作用，但其中的具体作用机制、在临床中是否也具有相似的效果还需要及进一步研究。