榆跳象性信息素的提取及组分分析

李 彪, 张建英*, 杨贵军, 郝凤霞

(1.宁夏大学 生命科学学院,宁夏 银川 750021;2.宁夏大学省部共建煤炭高效利用与绿色化工国家重点实验室,宁夏 银川 750021)

灰榆(Ulmusglaucescens)是宁夏贺兰山国家自然保护区最常见的一种乔木,尤其是在山体的向阳面,灰榆是唯一的一种乔木.作为贺兰山保护区内最常见的一种乔木,灰榆是岩羊、马鹿等许多动物的食物来源,并且对山体植被覆盖率有重要的影响.近年来,由于贺兰山植物群落单一,抑制害虫能力弱,灰榆林的专一性害虫榆跳象危害日趋严重.榆跳象(OrchestesalniLinnaeus)属鞘翅目象虫科,是榆树的重要食叶害虫之一[1],成虫和幼虫均危害榆树叶片.该虫在国内分布于上海、江苏、安徽、山东、天津、北京、内蒙古、辽宁、吉林、陕西、宁夏等地[1—2].榆跳象1 a发生1代[3],以成虫越冬,越冬成虫于4月上旬开始交配产卵,于4月中下旬幼虫孵化,以幼虫潜入榆树叶肉内危害[4].受害叶片表现为鼓起呈囊泡状[5],严重时叶片脱落,有时整株死亡.5月中旬羽化成虫出现并危害叶片,成虫一般自叶背取食叶肉,叶子被害后仅留下表皮或呈网眼状[1,4].以6月最严重，7月上旬成虫越夏.因榆跳象成虫和幼虫均危害榆树叶片,防治较为困难，目前主要通过化学方法防治[4,6].但在自然保护区、水源涵养地及人类活动较为频繁的地区，无法喷洒药物防治害虫,且不科学的化学防治易导致榆跳象产生抗药性,致使现有的防治药剂失去作用并对生态环境产生危害,因此迫切需要一种绿色无污染的方法防治榆跳象.通过性信息素制成性诱剂诱捕榆跳象,是一种高效且不污染环境的绿色防控方法.该方法有效地监测和防治害虫的发生,且具有用量少、灵敏度高、针对性强和对环境友好、不伤益虫等特点[7].目前,对榆跳象的研究主要集中在其生活史及习性[1]、发生规律[2]、空间分布和防治方法及建议等方面[8],关于其性信息素成分方面的研究较少.笔者采用有机溶剂浸提法,从榆跳象雌虫腺体内提取性信息素,通过气相色谱-质谱联用仪分析鉴定主要成分[7,9],确定榆跳象性信息素的主要成分,进而为榆跳象信息素的合成及林间诱捕研究提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验虫源

榆跳象成虫采自宁夏贺兰山国家自然保护区.于2019年4—6月在保护区内的灰榆(Ulmusglaucescens)上采集榆跳象成虫,存放在装有新鲜榆树叶片的塑料管(高8 cm,内径2.5 cm)内,并用专用透气盖封口.在实验室解剖镜下分辨雌雄,雌虫即为实验用虫.4—6月份的实验用虫分别为85，50，45只.

1.2 仪器和试剂

气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)(Agilent,5977B)、解剖镜、色谱进样瓶、解剖针、眼科手术剪、眼科镊子、注射器(2.5 mL)、0.22 μm的一次性过滤器.

正己烷(色谱级)、乙醇(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯).

1.3 提取方法

在解剖镜下,用镊子夹住雌性榆跳象成虫的胸部,再用解剖针轻压虫体腹部，将挤压出来的腺体用剪刀剪掉.将剪下来的腺体放入盛有正己烷的色谱瓶中浸泡，室温下静置3～5 h.用一次性注射器吸取上层清液.通过过滤处理,转移至洁净的色谱瓶中.在微弱的氮气流下浓缩至2 μL.通过GC-MS进行性信息素成分的测定.

1.4 分析条件

DB-5MS毛细柱(30 m×250 μm×0.25 μm).升温程序:40 ℃保持 3 min,然后每分钟上升 6 ℃到 270 ℃,保持3 min.进样口温度为260 ℃,溶剂延迟5 min.采集模式:SCAN,无分流进样,接口温度为 250 ℃,离子源温度为230 ℃.四极杆温度为150 ℃,载气为He,体积流量为 1 mL/min.EI 电子轰击,检测器电压为350 V,发射电流为 150 μA.采集速度为 0.6 s/次.原子质量单位采集范围为 40～330 amu.通过 NIST17软件进行数据的采集和分析.

2 结果与分析

4—6月份的榆跳象性信息素粗提取物的总离子流图见图1～图3,分别得到5，6，6种榆跳象性信息素组分,进一步确定这些物质的名称及结构(表1～表3).

图1 4月份榆跳象性信息素粗提取物的总离子流图

图2 5月份榆跳象性信息素粗提取物的总离子流图

图3 6月份榆跳象性信息素粗提取物的总离子流图

表1 4月份榆跳象性信息素粗提取物的性信息素组分

表2 5月份榆跳象性信息素粗提取物的性信息素组分

表3 6月份榆跳象性信息素粗提取物的性信息素组分

3 结论与讨论

采用有机溶剂浸提法提取榆跳象性信息素,在相同的实验条件下,对不同采集时间样本进行3次GC-MS分析.结果表明,4月份粗提取物中得到5种性信息素疑似物,5,6月份均得到6种性信息素疑似物.正二十七烷、2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基)苯酚、11,13-二甲基-12-乙酸酯、顺-9-十四碳烯酸异丁酯、1-二十二醇这5种化合物在3次检测分析结果中都存在,亚麻酸在后2次检测中存在.第1次提取物的可识别物质峰多,化合物的质量分数较高,有助于物质识别分析,而后2次物质的峰少且杂质少,但样品中的物质成分与性信息素成分更接近.

已知的昆虫性信息素主要成分为不饱和醇、醋酸酯、醛或酮类,所含杂质多为长链烷烃和油酸类物质[10—12].亚麻酸在第2次检测中的质量分数超过50%,在第3次检测中为25.94%，不符合性信息素是某一性别昆虫分泌于体外,能被同种异性个体所接受,并引起异性个体产生一定的行为和生理反应的微量化学物质的定义[9,11—13],由此可排除疑似物中的正二十七烷和亚麻酸.同时,昆虫性信息素在化学结构上有较大的相似性[10]：大多是由10～21个碳原子组成的直链化合物[11,14];含有1～3个碳碳双键且位置多在5,7,9或11位上,分子构型多为顺式;功能基多由伯醇及其乙酸酯等构成[14].因此,该实验提取物中2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基)苯酚、1-二十二醇不符合性信息分子所具有的共同特征.而11,13-二甲基-12-乙酸酯、顺-9-十四碳烯酸异丁酯满足昆虫性信息素所具有的一般特征,且3次检测到的质量分数较低,分别为1.23%,0.56%,1.52%;0.07%,0.05%,0.38%,符合性信息素是昆虫分泌于体外的微量化学物质这一特征.

3次GC-MS分析得到的11,13-二甲基-12-乙酸酯、顺-9-十四碳烯酸异丁酯都为酯类物质,这与鞘翅目昆虫铜绿丽金龟和华北大黑鳃金龟的性信息素的成分相似[15—16].已知的象甲科的华山松木蠹象(Pissodespunctatus)的性信息组分有十六碳烯酸甲酯、十六烷酸甲酯、十八碳烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、十八碳二烯酸甲酯等物质[17—18];甘薯象甲(Cylasformicarius)的性信息素成分有(Z)-3-十二碳烯基(E)-2-丁烯酸酯.上述2种象甲科昆虫的性信息素提取部位与该实验相同,都是雌虫腺体,且性信息素成分与该研究分析得到的物质相同(酯类物质),大灰象甲(Sympiezomiasvelatus)性信息素成分暂未确定,但得到了相关化合物,如2-壬烯-1醇、7-甲基-Z-十四碳烯-1-醇乙酸酯等[19].一般，昆虫性信息素中大多有2种或2种以上的化学成分,很少有1种化学成分[11,14].综上所述,该实验中3次检测得到的性信息素疑似组分11,13-二甲基-12-乙酸酯和顺-9-十四碳烯酸异丁酯,可以初步确定为榆跳象性信息素疑似物.

采用有机溶剂浸提法提取的榆跳象性信息受杂质的影响,可能存在微量物质缺失且缺乏榆跳象性信息素对比的参照物质问题.因此,还需通过触角电位,合成性信息素后进行诱捕实验等,进行进一步的分析和验证.