4 种柚子皮精油成分及其抑菌活性的研究

张方艳，葛国香，刘美伶，童 芳，朱桂兰，郭 娜

（合肥师范学院，安徽 合肥 236001）

我国是世界最大的水果生产国，果业至少占全国农业总产值的20%。随着水果加工工业的规模化和集约化，每年会产生大量的果皮。如果随意丢弃，则造成严重的环境污染和资源的极大浪费。水果果皮中含有丰富的活性成分，若加以合理利用，可以变废为宝，提高农产品的附加值，增加果农的经济效益，更能够消除污染源，有效解决果皮堆积造成的环境问题[1]。

柚是柑橘属植物果实中非常重要的一大类，我国柚类品种丰富，包括琯溪蜜柚、沙田柚、文旦柚、梁平柚和香柚等品种，我国每年有大面积种植，主要分布在福建、广东和浙江等地[2]。柚皮是柚子食用和加工的主要副产品，包括海绵状的果皮和充满油细胞的果皮，占柚子鲜质量的40%～50%。目前，除小部分柚皮外，大部分柚皮都被废弃，造成资源的极大浪费。柚子果皮油包中含有丰富的芳香类物质，可以提取出一种强芳香味复合物，多为萜烯类、醛类、黄酮类和多酚类等化合物，其中主要成分为柠檬烯，具有抗菌等作用，这是一种还没有得到充分开发利用的宝贵天然资源[3-6]。不同产地不同品种柚子皮中柠檬烯的含量及活性也不尽相同。因此，试验以沙田柚、文旦柚、梁平柚和香柚为原料，对4 种柚皮精油的柠檬烯得率、含量及抑菌活性进行了对比探究，旨在为柚皮精油在蔬果保鲜技术中的应用进行探索，以期为柚皮在食品领域方面的相关应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

柚皮：4 种柚皮分别来源于玉环文旦柚（浙江）、梁平柚（重庆）、香柚（湖南）、沙田柚（湖南），2019 年4 月份网购于上述产地。

菌种（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、霉菌），合肥师范学院微生物实验室提供。

1.1.2 试验试剂牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、氢氧化钠、琼脂，均为分析纯试剂；实验用水，均为蒸馏水。

1.2 仪器与设备

FA2204 型电子分析天平，上海市安亭电子仪器厂产品；7890B-5977A 型气相质谱色谱联用仪，安捷伦科技有限公司产品；挥发油提取装置（冷凝管、10 mL 挥发油提取器、200 mL 圆底烧瓶），天长市千马实验设备有限公司产品；98-1-B 型电子调温加热套（200 mL），天津市泰斯特仪器有限公司产品；DNP-9162.1A 型恒温培养箱、ZHP-Y2102F 型恒温振荡培养箱，上海三发科学仪器有限公司产品；SW-CJ-2FD 型（标准型） 双人单面垂直净化工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备产品；LDZM-80KCS 型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

新鲜柚子洗净，阴凉处晾干，剥皮、切片，去除白色海绵状部分和果肉，保留黄色外皮部分作为提取柚皮精油的材料。将柚皮切成0.1 cm×2 cm 长条，放入塑料密封袋中，置于冰箱中4 ℃下冷藏，备用。

1.3.2 柚皮精油的提取以及提取率计算

参照《中华人民共和国药典》2010 年版一部附录XD 甲法，精密称取4 种柚皮各20 g，分别置于200 mL 装有适量沸石的圆底烧瓶中，加入120 mL蒸馏水，振荡混匀后，连接挥发油提取器与回流冷凝管，自冷凝管上端加水，使挥发油测定器的U 形管内的水到达刻度线处，并出现有流入烧瓶内的现象时为止。放到电热套中缓慢加热至沸腾，然后调节电压至100 V，保持微沸，从微沸起计时4 h（直到精油量不再增加后停止加热），关闭电热套电源，放置冷却片刻，开启提取器下端的活塞，将水缓慢放出，再静置一段时间再开启活塞，使精油收到棕色收集瓶中，并用无水硫酸钠去除残留水分，得到柚皮精油，装瓶，密封，4 ℃冰箱中冷藏备用。

精油得率计算公式[7]：

式中：R——精油得率，%；

m1——精油质量，g；

m2——柚皮质量，g；

1.3.3 GC- MS 测试条件

色谱条件：色谱柱为安捷伦DB-5MS 型石英毛细柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm）；分流比为20∶1；载气（99.999 %氦气），流速1.0 mL/min；升温程序：起始柱温40 ℃，以10 ℃/min 的速率升到70℃，保持3 min，然后以3 ℃/min 的速率升到190 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min 的速率升到250 ℃，保持3 min；压力2.5 kPa，进样量1.0 μL。

质谱条件：电子轰击电子源，电子能量70 eV，传输线温度275 ℃，离子源温度230 ℃，激活电压1.5 V，质量扫描范围50～500 m/z，溶剂延迟时间3 min[8]。

1.3.4 精油组分定性定量分析与相关性分析

利用质谱信息与标准信息库NIST 11.0 进行相似度检索和特征峰分析对比，定量分析采用峰面积归一化法计算各种成分的相对含量。利用SPSS 24 软件对柚皮精油中的主要抑菌物质（d - 柠檬烯） 与抑菌活性进行相关性分析。

1.3.5 柚皮精油抑菌效果研究

（1） 培养基的配制。配制牛肉膏蛋白胨培养基、PDA 培养基、枯草芽孢杆菌培养基，备用。

（2） 抑菌性测定。采用滤纸片抑菌圈法测定柚皮精油的抑菌效果：在滤纸上用打孔器制出直径6 mm的圆形小纸片，高压灭菌锅灭菌后备用。将灭菌后的培养基冷却至40 ℃左右后，倒入培养皿中，做好标记，放置自然冷却，待培养基完全凝固后，向固体平板培养基中加入备用菌悬液100 μL，均匀涂布。紧接着，取灭菌小圆片贴在已涂布菌液的平板上，每片小圆片上滴加5 μL 的柚皮精油，每个平板均匀贴4 片。将平板放入培养箱，于37 ℃的条件下培养24 h，以浸无菌水的滤纸片作为空白对照。用游标卡尺交叉法测量抑菌圈直径，平行3 次，结果取平均值[9-12]。根据抑菌圈直径的大小判定组合物的抗菌敏感度。

2 结果与分析

2.1 4 种柚皮精油的提取率

4 种柚皮精油的提取结果见表1。

由表1 可以看出，4 种柚皮的精油提取率中文旦柚的提取率最高，为1.97%；其次是梁平柚和香柚，沙田柚的提取率最低，为1.56%，4 种柚皮精油的提取率为1.50%～2.00%。由此可见，这4 种柚皮精油的提取率有一定的差距，可能是由于不同品种柚皮的油胞含量的差异导致精油提取率的差别[13]。

表1 4 种柚皮精油的提取结果

郭畅等人[13]通过对水蒸气蒸馏方法的改进，用改进型Clevenger 装置也提取了沙田柚皮精油，精油得率为1.68%。刘昊澄等人[7]分别采用冷压榨、水蒸气蒸馏及机械磨皮3 种方法制备沙田柚皮精油，其中水蒸气蒸馏的精油得率为1.68%。上述文献报道均与试验测得沙田柚精油得率结果具有一致性。

2.2 柚皮精油物质成分分析与鉴定

梁平柚皮精油可挥发性成分及相对含量见表2，沙田柚皮精油可挥发性成分及相对含量见表3，香柚皮精油可挥发性成分及相对含量见表4，文旦柚皮精油可挥发性成分及相对含量见表5。

表2 梁平柚皮精油可挥发性成分及相对含量

表3 沙田柚皮精油可挥发性成分及相对含量

表4 香柚皮精油可挥发性成分及相对含量

表5 文旦柚皮精油可挥发性成分及相对含量

由表2 可知，4 种柚皮精油成分的鉴定率分别为文旦柚97.81%，沙田柚98.66%，香柚98.00%，梁平柚95.22%，共检出19 种化合物。4 种柚皮精油成分中的相同成分主要为d- 柠檬烯（55.34%～96.35%），β- 蒎烯（0.27%～35.30%） 等，其中d- 柠檬烯是所有样品的主要化合物，其相对含量分别为梁平柚59.11%，沙田柚93.48%，香柚96.35%，玉环文旦55.34%。这4 种柚皮精油的化合物成分也存在一定的差异性，其中梁平柚检测出16 种化合物，4 种柚皮精油中所含化合物种类最多，其中3 - 蒈烯（1.48%）、罗汉柏烯（0.55%） 等，仅在梁平柚精油中检测到；苯甲酸- 2 - 甲基丙酯（0.65%）、邻苯二甲酸二异丁酯（3.34%） 仅在沙田柚精油中检测到；3,5 - 二叔丁基邻苯二酚（0.2%）、3,4 - 环氧四氢呋喃（3.83%） 仅在文旦柚精油中被检出。通过查阅相关文献资料导致成分差异性的原因可能与产地、品种、贮藏条件、日照时间等因素相关，可以为柚皮中有机物的开发和利用提供参考。

2.3 柚皮精油抑菌活性

4 种柚皮精油的抑菌圈直径见表6。

表6 4 种柚皮精油的抑菌圈直径

由表6 可知，4 种柚皮精油对4 种受试菌的生长均有不同程度的抑制作用。整体上这4 种柚皮精油对酵母菌和霉菌抑制作用较明显，对酵母菌的抑菌圈直径为7～10 mm，对霉菌的抑菌圈直径为7～9 mm。对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌抑制作用不太明显，对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌圈直径为1～2 mm。

2.4 相关性分析

d - 柠檬烯是柚类果皮精油中主要挥发性活性物质，具有抗氧化和抗菌等功效[14-16]。因此，为进一步了解4 种柚皮精油中的d - 柠檬烯含量与抑菌活性之间的关系，利用相关性分析对柚皮精油中d - 柠檬烯成分和抑菌活性间的相关系数进行了计算（如表7），除枯草芽孢杆菌（-0.237） 为弱相关以外，d - 柠檬烯含量与其余3 种细菌的抑菌活性之间有极强的正相关（0.811～0.923） 关系，所以这4 种柚皮精油表现出来的抑菌活性的差异性很可能与d - 柠檬烯的含量有关。

4 种柚皮精油的主要抑菌化合物与抑菌活性间的相关性系数见表7。

表7 4 种柚皮精油的主要抑菌化合物与抑菌活性间的相关性系数

柑橘属植物精油是d - 柠檬烯最大的天然来源,其相对含量通常可达50%以上，在柚皮精油中可达95.82%[17]。d - 柠檬烯是一种天然的抗氧化剂和抑菌剂[17-18]，通常作为食用香精、香料被广泛应用于食品工业中，研究表明d - 柠檬烯具有很强的抗氧化能力和抑菌能力。因此，d - 柠檬烯很可能是柚皮精油中起主导作用的活性成分，4 种柚皮精油的抑菌活性差异可能与其含有的d - 柠檬烯的含量有关。

3 结论

我国含有丰富的柚类资源，柚皮作为柚类果实主要的副产品，未能充分开发利用，造成资源浪费和环境污染。有研究表明，柚皮精油中含有d - 柠檬烯， 具有降血糖、降血脂、抗菌和抗氧化等药理活性，能有效抑制各类微生物的生长，延长食品的保存期，而且具有良好的镇咳、祛痰作用[19]。 因此，柚皮精油在食品加工、医药保健和日化生产等方面具有极大的开发潜能。选取了我国4 个地区4 个不同品种的柚子，对其果皮精油进行了提取、易挥发物质测定及抑菌活性测定。结果表明，文旦柚的得率最高，为1.97%；其次是梁平柚（1.89%）、香柚（1.61%），最低的是沙田柚（1.56%）。利用GC-MS方法检测分析柚皮精油的组成成分，4 种精油共检出19 种化合物，其中具有广谱抑菌作用的d - 柠檬烯含量都高于50%，沙田柚和香柚中的d - 柠檬烯含量在90%以上。然后进行柚皮精油抑菌试验，探究4 种柚皮精油的抑菌效果并进行比较，发现柚皮精油中d - 柠檬烯含量高的柚子品种的抑菌活性高，其中香柚精油对于酵母菌达到了中度敏感，4 种精油对于大肠杆菌和枯草芽孢杆菌表现出较敏感。对柚皮精油中d - 柠檬烯含量和抑菌圈大小进行相关性分析，发现d - 柠檬烯含量与其余3 种细菌的抑菌活性之间呈极强的正相关（0.811～0.923） 关系。

综上，4 种柚皮精油得率和主要成分d - 柠檬烯含量因产地、品种的不同而不同；柚皮精油中的d -柠檬烯具有抑菌性能，其抑菌性能与d - 柠檬烯含量呈正相关。试验结果对柚皮精油的开发和应用提供一定的参考依据。