温肾强骨丸对脾肾阳虚型骨质疏松症大鼠骨密度、骨生物力学的影响

王雨榕， 邓 强， 李中锋， 彭冉东， 李军杰， 乔小万

(1.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050；2.甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；3.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730030)

骨质疏松症是老年性人群常见的疾病之一，严重影响老年人群的生活质量，近年来研究发现，中药及复方制剂在治疗骨质疏松症上有独特的优势，具有良好的防治作用。目前，关于骨质疏松症的基础研究已深入到分子生物学层面，但对于中医药相关作用机制仍缺乏报道。由于人类脾肾阳虚型骨质疏松症的发生比较复杂，因此造模方法也多种多样[1-2]，本研究探讨温肾强骨丸防治脾肾阳虚型骨质疏松症大鼠的作用机制，以期为相关临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级SD大鼠60只，雌性，体质量(200±20)g，购自甘肃中医药大学SPF级实验动物中心，实验动物生产许可证号SCXK(甘)2015-0005，伦理审查号2019-035，喂养于甘肃中医药大学动物实验中心(SPF级)，给予普通大鼠颗粒饲料和高压灭菌的自来水，环境温度控制在4～18 ℃。光照、暗室时间均为7：00～19：00,相对湿度控制在45%～65%。

1.2 试剂与药物 氢化可的松注射液(紫光古汉集团衡阳制药有限公司，国药准字H43021210)；温肾强骨丸(甘肃省中医院，批号20180926)；阿仑膦酸钠(杭州默沙东制药有限公司，国药准字J20130085)。番泻叶(甘肃省中医院中药药房)，制备为水煎液。水合氯醛(天津市大茂化学试剂厂，批号20181006)；4%多聚甲醛溶液(武汉赛维尔生物科技有限公司，批号XS190201)；甘蓝、精炼猪油自备；蒸馏水、生理盐水、苦味酸均由甘肃中医药大学实验中心提供。

1.3 仪器 双能X线骨密度检测仪(美国GE公司)；AG-X系列台式电子万能试验机(日本岛津公司)；硬组织切片机(德国Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1 造模 大鼠适应饲养后，随机分为正常组、假手术组、模型组、西药组及温肾强骨丸高、中、低剂量组，除正常组外，其余各组大鼠参照文献[3-4]报道的去势(切除雌性大鼠双侧卵巢)+注射氢化可的松+番泻叶灌胃+饮食失节+劳倦过度法进行造模。大鼠禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)，剔除两侧腹部皮毛，75%酒精消毒，在双侧肋下1～1.5 cm处纵向切开入腹，结扎双侧卵巢动脉，切除双侧卵巢及周围脂肪，逐层缝合[5]；假手术组只暴露双侧卵巢，不做切除，去势术后第2天每天上午9时用番泻叶水煎液灌胃，每只2 mL，正常组、假手术组大鼠给予等量生理盐水灌胃，下午3时将大鼠置于38 ℃恒温水浴中游泳至疲劳(疲劳标准为全身下沉至没颈，不能坚持游泳)，每只单日喂饲甘蓝10 g，双日喂饲精炼猪脂2 mL，正常组、假手术组大鼠予普通饲料，其间各组大鼠均自由饮水[6]，术后1周开始肌肉注射氢化可的松注射液(2 mL/10 mg)5 mg/kg，假手术组大鼠肌注等量生理盐水，每周4次。通过一般活动，包括活动度、毛发、爪甲颜色、大便质地、饮食、饮水量等来评价脾肾阳虚证造模是否成功，骨密度、骨生物力学及椎体HE染色来评价骨质疏松症造模是否成功。

1.4.2 给药 温肾强骨丸高、中、低剂量组大鼠给药剂量分别为1.72、0.86、0.43 g/kg，每天1次；正常组、模型对照组大鼠以等剂量生理盐水灌胃；西药组按人鼠等效剂量灌胃给予阿仑膦酸钠，每周1次，每次6 mg/kg，持续8周。

1.5 指标检测

1.5.1 一般状态 包括大鼠形态、毛发色泽、爪甲颜色、活动度、饮食情况、粪便形态及次数。造模结束后，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取左侧股骨，剔除肌肉、筋膜等组织，生理盐水纱布块包裹，于-20 ℃冰箱中保存；取第5腰椎，剔除肌肉组织，于4%多聚甲醛溶液中保存。

1.5.2 骨密度 将大鼠麻醉后置于双能X线骨密度仪下，检测股骨、脊柱骨密度[7]。应用万能材料试验机进行股骨三点弯曲试验，将冻存的大鼠左股骨自然解冻后置于AG-IS生物力学万能试验机上，设定跨距15 mm,加载速度10 mm/min,计算机记录载荷变形曲线及最大载荷、弹性模量、断裂点载荷[8-9]。将第5腰椎用10%EDTA溶液中脱钙石蜡包埋，切片脱蜡后用苏木精和伊红(HE)染色，然后在光学显微镜下观察拍照[10-12]。

2 结果

2.1 一般状态 在造模第6～8周，模型组大鼠出现了便溏、掉毛、喜扎堆、尾巴凉等脾肾阳虚症状，说明造模成功；温肾强骨丸干预后第4～6周，与模型组比较，温肾强骨丸组大鼠上述症状改善。

2.2 骨密度 与正常组比较，模型组大鼠股骨与脊柱骨密度均降低(P<0.05)，说明造模成功；假手术组大鼠骨密度略有下降，但差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，温肾强骨丸组、西药组大鼠股骨、脊柱骨密度均升高(P<0.05)，见表1。

表1 各组大鼠股骨、脊柱骨密度比较

2.3 股骨三点弯曲骨生物力学 与正常组比较，模型组大鼠弹性模量、最大载荷、断裂点载荷均下降(P<0.05)，说明造模成功；与模型组比较，温肾强骨丸高剂量组、西药组大鼠弹性模量、最大载荷值、断裂点载荷升高(P<0.05)，而中、低剂量组弹性模量也升高(P<0.05)，但最大载荷值、断裂点载荷无明显变化(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠股骨生物力学指标比较

2.4 椎体HE染色 正常组大鼠椎体骨组织呈粉红色，椎体内网状结构为骨小梁；与正常组比较，模型组大鼠骨小梁密度减少、变窄，骨小梁间距增加；与模型组比较，温肾强骨丸高剂量组大鼠骨小梁密度增加，骨小梁间距增宽，见图1。

图1 各组大鼠椎体HE染色(×200)

3 讨论

温肾强骨丸为甘肃省中医院脊柱骨二科经验方药，由淫羊藿、骨碎补、枸杞子和丹参等7味中药组成，具有温肾强骨、活血通络之功效，经多年临床运用，治疗脾肾阳虚型骨质疏松症取得良好效果，因此，本实验基于临床疗效观察，来研究它对脾肾阳虚型骨质疏松症大鼠的防治作用，为临床广泛运用温肾强骨丸提供实验依据。

采取去势(切除大鼠卵巢)+注射氢化可的松+番泻叶灌胃+饮食失节+劳倦过度方法联合造脾肾阳虚型骨质疏松症大鼠模型，将病症相结合，更好模拟人类的发病机制。实验结果显示，温肾强骨丸干预后能改善脾肾阳虚型大鼠的一般状况，说明温肾强骨丸能缓解脾肾阳虚型症状。模型组大鼠下肢及椎体骨量的流失，骨密度及骨生物力学均出现下降，并用温肾强骨丸干预后，高剂量组骨密度及骨生物力学也增高，大鼠骨质改善。大鼠一般状态及活动的观察，可与人类脾肾阳虚症状相对应。大鼠出现的症状与人类脾肾阳虚的临床表现一致，则证明造模成功。通过骨质疏松症发病机制的研究，发现骨密度、骨生物力学及骨病理学观察等均可反应骨组织的生长状况[13-15]。将上述实验室指标作为判断大鼠骨质疏松症造模成功和干预结果的标准。HE染色可以直观的反映出骨小梁的形态及间隔的变化，是骨组织形态学研究最重要的方法，能更好的反映大鼠骨质疏松程度。实验结果显示温肾强骨丸高剂量增加了椎体骨组织中骨小梁的厚度、增加了骨小梁之间的间距，使骨组织中骨小梁数量增加，改善骨组织质量。

目前对于中医证候的评价标准仍未统一，未来需要进一步进行实验验证[16-18]。本实验采取复合多种造模方法，但干扰因素较多，需进一步简化造模方法，以期制备更适合的动物模型。本研究通过动物实验证实了温肾强骨丸能明确改善脾肾阳虚型骨质疏松大鼠的脾肾阳虚症状、骨密度以及骨生物力学，这表明它对脾肾阳虚型骨质疏松有一定的防治作用，但是其药动学仍需进一步研究，并且其作用机制不明确，未来可基于骨质疏松症发生的信号通路进一步深入研究它对骨代谢影响的作用机制，为将来温肾强骨丸的广泛临床应用提供研究基础，推动中药靶向治疗和个体化治疗的发展。