基于网络药理学技术研究桂枝颗粒治疗鼻炎的作用机制

孙元芳， 刘辉见， 肖 雪， 张怡萍， 李莎莎， 严诗楷1,

(1.上海交通大学药学院，上海 200240；2.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510006；3.山西太行药业股份有限公司，山西 长治 046000；4.广东药科大学中医药研究院，广东 广州 510006)

鼻炎是病毒、细菌、变应原、各种理化因子以及某些全身性疾病引起的鼻腔黏膜炎症，其临床表现为鼻塞、多涕、嗅觉下降以及头昏、头痛等[1-2]。中医理论认为，鼻炎多由肺气虚寒，卫表不固，则腠理疏松，风寒之邪或异气易于乘虚而入。临床常用桂枝汤加减方解肌发表，调和营卫。

桂枝汤由桂枝、芍药、生姜、大枣、甘草配伍而成。此方性温味辛，既能温肺，又能驱邪以通窍，同时调和营卫以达到改善体质的作用。现代临床研究表明桂枝汤通过减少鼻分泌物，保护鼻黏膜组织，减少血清中组胺、免疫球蛋白E(IgE)的表达[3]，抑制T辅助细胞2(Th2)的分泌功能，减少白介素4(IL-4)的释放[4]，抑制嗜酸性粒细胞的聚集、活化[5]，缓解鼻炎症状。桂枝颗粒作为桂枝汤的现代制剂，也具有治疗鼻炎的作用，但其治疗鼻炎作用机制尚未见报道。

本研究拟从网络药理学的角度出发，预测桂枝颗粒治疗鼻炎的药效成分和潜在靶点，并通过基因本体(GO)功能分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析得到与桂枝颗粒治疗鼻炎相关的信号通路和代谢途径。本研究结果为揭示桂枝颗粒治疗鼻炎的作用机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 桂枝颗粒药效成分与靶点的收集 在中药系统药理数据库及分析平台(TCMSP)数据库(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)中搜索白芍、甘草、桂枝、生姜、大枣中文名，得到的化学成分经过去重合并，即为桂枝颗粒成分，筛选出同时满足生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18者，即为潜在药效成分。根据TCMSP数据库中药效成分的“Related Targets”收集药效成分相关靶点，采用Cytoscape3.7.0软件对成分与靶点的关系进行可视化处理。

1.2 鼻炎相关靶点的获取及蛋白互作网络的构建 利用GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)搜索鼻炎英文名“rhinitis”，得到与鼻炎相关的基因。将疾病靶点输入STRING数据库(https://string-db.org/)，进行蛋白互作分析，并导出为.tsv文件。将文件中node1、node2信息导入Cytoscape3.7.0软件，绘制蛋白互作网络。

1.3 桂枝颗粒治疗鼻炎的关键药效成分和潜在靶点获取 对桂枝颗粒药效成分靶点与鼻炎相关靶点进行匹配分析，筛选出桂枝颗粒治疗鼻炎潜在靶点，并根据潜在靶点与药效成分的关系筛选出桂枝颗粒的关键药效成分，整理它们与潜在靶点之间的关系，利用Cytoscape3.7.0软件，构建桂枝颗粒-关键药效成分-靶点-疾病网络。

1.4 生物信息学分析 通过Cytoscape3.7.0软件中的ClueGO插件，对桂枝颗粒治疗鼻炎潜在靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，构建靶点-通络网络。再导出结果，筛选合适的通路，与桂枝颗粒-关键药效成分-靶点-疾病网络合并，建立桂枝颗粒-关键药效成分-靶点-通路-疾病网络。

2 结果

2.1 桂枝颗粒药效成分与靶点的收集 桂枝颗粒药效成分共有113种。从TCMSP数据库中得到其相关靶点267个，采用Cytoscape3.7.0软件构建药效成分-靶点网络。图1显示，该网络中共有380个节点，2 084条边，网络中心度为0.379，平均邻居节点数为10.968，说明网络各节点间相关性较高。

注：代表药效成分，代表靶点。

2.2 鼻炎相关靶点的获取及蛋白互作网络的构建 GeneCards数据库中输入rhinitis检索鼻炎相关靶点，得到1 415个基因。将靶点输入STRING数据库得到蛋白互作网络，利用Cytoscap3.7.0软件对疾病靶点互作网络可视化，得到疾病靶点互作图，见图2。由此可知，该网络共有412个节点，7 502条边，网络中心度为0.393，平均邻居节点数为36.417。

注：代表靶点。

2.3 桂枝颗粒治疗鼻炎的关键药效成分和潜在靶点获取 桂枝颗粒治疗鼻炎的潜在靶点共22个，分别为雄激素受体(AR)、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)、芳香烃受体(AHR)、过氧化氢酶(CAT)、CD40配体(CD40LG)、C-反应蛋白(CRP)、双氧化酶2(DUOX2)、表皮生长因子受体(EGFR)、谷胱甘肽S-转移酶MU 1(GSTM1)、血红素加氧酶1(HMOX-1)、细胞间黏附分子1(ICAM1)、γ干扰素(IFNγ)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、MAPK14、MAPK3、MAPK8、髓过氧化物酶(MPO)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、孕酮受体(PGR)、信号转导与转录激活因子3(STAT3)、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)，具体信息见表1。根据潜在靶点与药效成分的关系，筛选出桂枝颗粒的关键药效成分82种，包括黄酮类、萜类、香豆素、生物碱、植物甾醇，见表2。整理关键药效成分与关键靶点之间的关系，构建关键药效成分-靶点网络，见图3。

表1 桂枝颗粒治疗鼻炎的潜在靶点

表2 桂枝颗粒治疗鼻炎潜在关键有效成分信息表

注：代表药效成分，代表靶点。

2.4 生物信息学分析 利用Cytoscape3.7.0软件中ClueGO插件对22个桂枝颗粒治疗鼻炎潜在靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，结果见图4(Group00代表peptidyl-tyrosine autophosphorylation，Group01代表regulation of morphogenesis of a branching structure，Group02代表regulation of protein deacetylation，Group03代表nuclear receptor activity，Group04代表hydrogen peroxide metabolic process，Group05代表positive regulation of protein localization to cell periphery，Group06代表positive regulation of protein localization to plasma membrane，Group07代表negative regulation of lipid storage，Group08代表positive regulation of reactive oxygen species metabolic process，Group09代表reactive oxygen species biosynthetic process，Group10代表astrocyte differentiation)。在GO功能富集分析过程中，共确定了93条生物过程GO条目，主要涉及脂质贮存、核受体活性、蛋白定位、细胞分化、氧化应激等方面；通过KEGG通路富集分析，筛选P<0.05且至少匹配3个靶点基因的通路，共得到9条信号通路与桂枝颗粒治疗鼻炎相关，其中TNF信号通路、叉头转录因子(FoxO)信号通路、高亲和力IgE受体(Fc epsilon RI)信号通路、T细胞受体信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路、Th17分化、松弛素(Relaxin)信号通路、缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路与桂枝颗粒治疗鼻炎的潜在作用机制相关，见图5。将桂枝颗粒82种关键药效成分、22个潜在作用靶点、9条信号通路关联建立桂枝颗粒-关键药效成分-潜在作用靶点-信号通路-鼻炎网络，见图6。

续表2

图4 22个潜在靶点的GO功能富集分析

图5 22个潜在靶点的KEGG通路分析

注：代表药效成分，代表靶点，代表通路，代表鼻炎。

3 讨论

3.1 桂枝颗粒治疗鼻炎的潜在药效成分 黄酮类、萜类、香豆素、生物碱、植物甾醇5大类成分可能是桂枝颗粒治疗鼻炎的物质基础。黄酮类成分包括槲皮素、山柰酚、甘草查尔酮A等。槲皮素对卵清蛋白诱导的过敏性鼻炎有缓解效果[6]；槲皮素和山柰酚治疗过敏性鼻炎的作用机制与HMOX-1[7-8]和抑制IgE介导的TNF-α和IL-6的产生相关[9]；甘草查尔酮A能抑制单核细胞和T细胞免疫相关细胞因子的产生，具有免疫调节作用[10]。这些研究报道与本研究结果一致，提示黄酮类成分是桂枝颗粒治疗鼻炎的物质基础。

萜类成分包括芍药苷、苍耳酮、桦木酸和β-胡萝卜素，生物碱包括小檗碱和荷叶碱，植物甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇和川贝海绵甾醇。目前虽尚无文献报道这些成分与鼻炎之间的直接联系。但这4类化合物都具有调节免疫，抑制炎症反应的作用[11-14]。结合本研究结果可推测桂枝颗粒中的黄酮类、萜类、香豆素、生物碱、植物甾醇等成分可能是其发挥治疗鼻炎疗效的物质基础。

3.2 桂枝颗粒治疗鼻炎的关键通路 桂枝颗粒通过多成分-多靶点-多通路发挥治疗鼻炎的药效。KEGG通路富集分析发现，桂枝颗粒治疗鼻炎的作用机制涉及TNF、FoxO、Fc epsilon RI、T细胞受体、IL-17、MAPK、Th17、Relaxin和HIF-1等信号通路。

TNF信号通路可触发NF-κB和MAPK途径。TNF是一种可以直接杀伤肿瘤细胞，对正常细胞没有明显细胞毒性的细胞因子。其参与全身炎症反应，是组成急性期反应的细胞因子之一。王忠喜[15]研究表明在变应性鼻炎的发病中TNF-α和IL-8发挥了重要的作用。Fc epsilon RI复合物是由抗原特异性IgE的Fc端与细胞表面高亲和力受体相互作用而形成，过敏性鼻炎中Fc epsilon RI复合物水平增加，可进一步诱导B细胞中的IgE合成，加重鼻炎[16]。桂枝颗粒可能通过降低Fc epsilon RI复合物水平达到缓解鼻炎的作用。T细胞表面的T细胞受体可特异性识别抗原提呈细胞表面主要组织相容性复合体提呈的抗原肽，并激活T细胞内部细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶、NF-κB等信号通路，从而调控T细胞的增殖、分化、死亡。Th17细胞是由Th0细胞在IL-6和转化生长因子β的刺激下分化而成的，在免疫调节、宿主防御和自身免疫性疾病中发挥关键作用。石小伟等[17]研究表明间歇性变应性鼻炎患者外周血中Th17细胞占外周血中CD4+T淋巴细胞的比例在间歇期降低，发作期前、发作期升高，表明Th17细胞表达与过敏性鼻炎发病有关。Cheng等[18]研究表明过敏组中产生IL-17α的调节性T细胞增加，同时过敏组中调节性T细胞抑制效应Th17产生的能力显著降低。IL-17在宿主免疫学中起关键作用，其可以保护宿主抵抗细胞外病原体，但也可以激活MAPK、NF-κB等途径中的抗细胞因子和趋化因子，促进自身免疫性疾病的炎症病理。 Lv等[19]观察到百里香可降低IL-17基因表达，减轻过敏性鼻炎症状。MAPK信号通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的重要信号转导系统，调节细胞的生长、分化、凋亡和死亡等多种生理过程。Liu等[20]研究认为p38 MAPK信号通路调控Th2细胞因子释放，导致过敏性鼻炎的发病。既往研究[21]显示HIF-1α可缓解过敏性鼻炎模型小鼠的鼻炎症状。

4 结论

本研究基于网络药理学技术，揭示了桂枝颗粒中黄酮类等成分调控免疫相关通路治疗鼻炎的作用机制，可为阐明该制剂治疗鼻炎的作用机制提供了研究基础，但这些成分与靶点、靶点与靶点之间的相互关系还需要进一步的实验来验证。