普萘洛尔对胶质母细胞裸鼠移植瘤模型的干预作用

刘世霞，刘 艳，周良健，李兴兰，赵 琪

(1锦州医科大学，辽宁 锦州 121001；2临沂市人民医院，山东 临沂 276000)

胶质瘤是最常见的原发恶性脑肿瘤，约50%为胶质母细胞瘤，恶性程度高。目前，主要治疗手段有手术、化疗、放疗及靶向治疗等，但中位生存期仍然小于15个月。胶质母细胞瘤为富血供肿瘤，抗血管生成药物贝伐单抗已被FDA批准用于胶质母细胞瘤的治疗。但贝伐单抗成本高，出血、高血压、蛋白尿等风险高。普萘洛尔是临床应用的经典老药，经济、安全，是目前治疗婴儿血管瘤的一线药物，具有抑制血管生成作用[1]。本研究将其应用于胶质母细胞瘤裸鼠移植瘤模型，观察其干预效果，探讨胶质母细胞瘤治疗的新思路。

1 材料与方法

1.1实验材料 24只BALB/C Nude雌性小鼠[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006]，SPF级，6～7周，体重15.73～18.79 g，平均(17.04±3.51)g。U251细胞株(鲁南制药集团股份有限公司新药药理中心)。

1.2方法 将U251细胞株于37℃、5%CO2恒温培养箱培养，培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，换液、传代，待细胞生长至培养瓶的80%以上时，胰蛋白酶消化细胞，待细胞消化至圆形，加入10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基终止消化，1000 rpm离心5 min，弃上清液，将沉淀物用0.9%氯化钠注射液重悬至1.08×108个/ml细胞，共1.5 ml，与1.5 ml基质胶(康宁公司)混匀后冰上备用，于清洁区中按照0.1 ml/只接种于裸鼠左侧腋下(在种植前1只意外死亡，共接种23只)。待平均瘤体增长至约100 mm3时，将移植瘤模型裸鼠随机分为对照组(11只)和实验组(12只)，对照组给予安慰剂灌胃(纯水10 ml/kg)、实验组给予普萘洛尔灌胃(4mg/kg，纯水配置后10 ml/kg)，1次/d，连续12 d，观察裸鼠体重及肿瘤生长情况，第13天处死小鼠，采集肿瘤组织，经10%中性福尔马林溶液固定，脱水、石蜡包埋，5μm切片，每例挑选2片采用莱卡公司hMark XT全自动免疫组化机，应用EnVision法进行染色，检测血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、低氧诱导因子1A(HIF1A)。

1.3指标评定 每张切片于高倍镜下(×400)随机选5个视野，每个视野计数100个细胞，数出阳性细胞数目，换算成百分比，取其平均数。VEGFA的评判标准：将10%以下记为低表达，其余记为高表达；HIF1A的判读标准：将25%以下记为低表达，其余记为高表达。

2 结果

2.1两组体重及肿瘤体积的比较 给药第10天实验组1只裸鼠意外死亡。两组小鼠用药前后的体重及肿瘤体积比较均无统计学意义。见表1。

表1 两组用药前后裸鼠体重及肿瘤大小

2.2两组免疫组化检测比较 两组VEGFA蛋白表达强度无统计学意义，HIF1A蛋白表达强度有统计学意义。见表2。

表2 两组VEGFA、HIF1A蛋白表达强度

3 讨论

恶性胶质瘤生长需要血管生成，该过程主要由肿瘤分泌的VEGF-A驱动，肿瘤中VEGF的生成水平随着其恶性程度的增加而增加。越来越多的证据表明，普洛萘尔可以抑制多种恶性肿瘤生长，但可能通过不同的生物途径介导，其机制包括抑制VEGF的表达、阻断β-肾上腺素能信号、抑制 AKT/MAPK信号通路等[2-5]。

HIF可以上调促癌基因的转录[6]，其过度表达已经在多种肿瘤中被发现，参与血管生成、铁代谢、糖代谢和细胞增殖/存活等，靶向HIF可能是癌症治疗的一种方法。有研究显示，普萘洛尔治疗以时间和剂量依赖性方式降低肿瘤组织中的HIF-1A水平[7]。可以考虑在以后的实验中延长普萘洛尔治疗时间及增加普萘洛尔剂量。

本实验分别从肿瘤大小和蛋白表达两个方面探讨普萘洛尔对U251胶质母细胞瘤裸鼠移植瘤模型的干预作用，结果显示：实验组肿瘤体积及VEGFA蛋白表达与对照组相比无统计学意义，HIF1A蛋白表达低于对照组。表明普萘洛尔可抑制U251细胞系裸鼠移植瘤模型肿瘤的HIF1A蛋白表达，对肿瘤体积及VEGFA蛋白表达无明显影响。

胶质母细胞瘤是一种遗传异质性肿瘤，分子分型不同，基于基因表达将胶质母细胞瘤分为前神经亚型、神经亚型、经典亚型和间充质亚型，揭示不同分型需要不同治疗，需要针对肿瘤特异性途径进行更有效的治疗。所以应用不同胶质母细胞瘤细胞系研究普萘洛尔的干预作用可能会有不同结果。

综上所述，考虑到普洛萘尔的用药时长、剂量、抗癌治疗的联合用药及胶质母细胞瘤的异质性，未来需增加时长及剂量、联合用药及应用更多细胞系的实验验证普萘洛尔对胶质母细胞瘤的干预作用。