‘鸠坑种’有性后代儿茶素类和咖啡碱含量变异及其管理

羊文伟 寿松涛

（1.杭州市富阳区银湖街道区域发展与治理中心，杭州 311400；2.杭州市富阳区乡村振兴服务中心，杭州 311400）

茶树是异花授粉植物，长期异花授粉使其形成高度杂合的遗传特性，以至于同一株茶树的种子后代也产生严重的性状分离。这种遗传分离，使有性系品种快速退化，给茶树有性系品种的培育和推广带来了困难。然而，这种遗传分离，也为无性系茶树品种的选育提供了广泛的选择机会。现有关于茶树有性后代的性状分离的研究，多停留在性状的综合描述，而对群体内化学成分分离的测试数据却不多。为此，本研究测定了‘鸠坑种’种子后代群体茶叶儿茶素类和咖啡碱含量的分离变异，为优良无性系选择提供参考。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

本研究所用的试剂主要有：甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸（色谱纯），咖啡碱（CAFF，≥98%）、儿茶素（C，≥98%）、没食子酸（GA，≥98%）、表儿茶素（EC≥98%）、表没食子儿茶素（EGC，≥98%）、没食子儿茶素（GC，≥98%），儿茶素没食子酸酯（CG，≥98%）、表儿茶素没食子酸酯（ECG，≥98%）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，≥98%）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG，≥98%）（均购于阿拉丁试剂（上海）有限公司）。乙醇、乙腈和乙酸购于国药试剂集团化学试剂有限公司（中国上海），均为色谱纯；试验用水均为实验室自制ddH2O。

本研究所用的试验仪器有：HH-6数显恒温水浴锅（江苏金坛市杰瑞尔有限公司），AB265-S分析天平（梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司），赛默飞Sorvall Legend Micro 17R离心机（上海旦鼎国际贸易有限公司），KQ5200DA型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），超纯水仪（赛默飞世尔科技公司，上海市浦东新区），LC-20 AD高效液相色谱仪（日本岛津公司，日本京都）。

1.2 植物材料

本研究所用的茶树材料为‘鸠坑种’茶树品种1个植株上采集的种子培育的3年生茶树单株20株，于2020年4月10日采集一芽二叶新梢，每个单株采集100～150 g，以同时期采摘的‘鸠坑种’新梢为对照；采下的鲜叶直接用蒸汽杀青1分钟，（80.0±1.0）℃烘干至含水量约5%，粉碎并过16目筛，包装于铝塑符合自封袋，保存于（4.0±1.0）℃备用。

1.3 试验方法

1.3.1 含水量测定 参照中华人民共和国国家标准“GBT 8304－2013茶水分测定标准”中120℃快速烘干法测定茶叶含水量。干净带盖铝盒于（103±2）℃烘干1 h，取出并放入干燥盒冷却至室温，然后称重（Mp）；再称取茶叶样品4 g（M1）置于干燥铝盒中，开盖，在120℃烘干1 h，盖上盖子，取出放如干燥器快速冷却至室温，第二次称重（M2）。按照以下公式计算样品含水量：水分（%）＝100*［（Mp＋M1）－M2］／M1。

1.3.2 样品萃取 称取0.15 g磨碎备测的茶叶样品，放入50 mL离心管，加入25 mL浓度为50%生物遗传，于70℃水浴浸提20 min，浸提中每隔5 min将样品摇动1次，浸提完成后取出冷却至室温，转入10 mL离心管中，在5 000 rpm离心10 min，吸取上清液待测。

1.3.3 儿茶素类和生物碱测定 用HPLC法检测儿茶素类和生物碱含量。HPLC条件：色谱柱为安捷伦TC 4.6 mm×250 mm C18，柱温35℃；流动相A是比例为3∶0.5∶96.5的乙腈／乙酸／水混合液；流动相B为30∶0.5∶69.5的乙腈／乙酸／水混合液；流速1 mL／min；线性梯度洗脱：流动相B在35 min内从20%提高到65%；进样量10μL；测波长为280 nm。根据儿茶素类和生物碱标准品的保留时间以及峰面积对被测样品的标的物分别进行定性和定量。

2 结果与分析

2.1 茶叶儿茶素类含量

表1显示，‘鸠坑种’种子后代20个单株的儿茶素类化合物含量存在明显差异，儿茶素类总含量变异范围在185.69±0.18 mg／g（第8株）到286.32±6.34 mg／g（第12株），后者为前者的1.54倍。对照的儿茶素类总含量（236.32±9.99 mg／g）居于两者之间。与对照相比，儿茶素类总含量最低者是对照的78.58%，而含量最高者为对照的121.16%。按照儿茶素类总含量为横坐标，以相应含量的株数为纵坐标作图显示，儿茶素类总含量的分布基本呈现正态分布（图1）。

图1 儿茶素类总含量分布

（－）-表没食子酸儿茶素没食子酸酯（EGCG）是茶叶最主要的儿茶素类化合物。表1显示，第20号单株（68.78±1.25 mg／g）含量最低，第13号单株（140.75±5.31 mg／g）含量最高，后者为前者的2.05倍。按照含量水平不同的株数分布图也呈现正态分布（图2）。该结果说明，通过杂交或者有性后代的性状分离群体，有可能筛选出高EGCG的单株。

图2 EGCG含量分布图

2.2 咖啡碱含量

咖啡碱是茶叶重要品质成分和功能物质，‘鸠坑种’后代咖啡碱含量也产生明显分离现象（表1）。含量分布范围是从30.66±1.16 mg／g（第18株）至43.34±1.71 mg／g（第15株），分别为对照（38.63±0.45 mg／g）的79.37%和112.19%。含量分布也呈现正态分布现象（图3）。

表1 高EGCG茶树品系初步筛选（mg／g）

图3 咖啡碱含量分布图

根据各种成分在各株之间分布的变异系数判断，咖啡碱含量的变异系数最小（6.94%），而（＋）-儿茶素没食子酸酯（CG）的变异系数最大，达到253.96%；其它成分的变异系数介于咖啡碱和CG之间（表1）。儿茶素类总含量和EGCG含量的变异系数分别为15.39%和29.30%。种子繁殖后代咖啡碱含量的变异系数小，说明：欲从种子繁殖后代和杂交手段培育咖啡碱含量超低的株系可能性较小。