基于响应面设计的头孢他啶母液冷冻浓缩工艺优化

贾全，胡利敏，任峰，张建丽，田洪年，刘树斌

(华北制药河北华民药业有限责任公司，河北 石家庄052165)

头孢他啶是由葛兰素史克公司研制的第三代头孢菌素类抗生素，具有广泛的抗菌谱和良好的用药效果[1]。国内生产企业通常以头孢他啶二盐酸盐为原料,通过等电点结晶制备头孢他啶[2]。由于制备过程中头孢他啶析晶不完全，导致部分产品仍然残留在母液中。如果将母液直接排放至三废，不仅影响产品收率，还会增加企业污水处理费用，对环境造成较大伤害，也增加了企业成本。

目前头孢类抗生素结晶母液处理方法包括纳滤膜分离法[3]、树脂吸附法[4]、络合法[5]、冷冻浓缩法[6-7]等。采用纳滤膜分离结晶母液，设备采购及维护成本较高；使用树脂吸附有效成分，还需要对树脂进行再生处理，操作过程繁琐；以苯系和萘系化合物为络合剂进行络合，收率较低，且使用大量易挥发性有机溶剂，极易造成大气污染；而冷冻浓缩法作为近年来发展迅速的一种浓缩方式，其原理简单，操作便捷，已被广泛应用于食品加工、酿酒业、中药等领域[8-11]。

冷冻浓缩法根据结晶方式的不同，又分为悬浮结晶冷冻浓缩法和渐进冷冻浓缩法。悬浮结晶冷冻浓缩法是一种不断排除在母液中悬浮的自由小冰晶，使母液浓度增加而实现浓缩的方法。渐进冷冻浓缩是一种随着冰层在冷却面的生成和成长，固液界面附近的溶质被排除到液相侧，导致液相中溶质质量浓度逐渐升高的浓缩方法。文献[7]以头孢他啶结晶母液为原料，使用渐进冷冻浓缩法进行回收处理，考察了冷冻温度、冷冻时间对头孢他啶回收效果的影响，但此方法冰晶夹带率高，易损失物料，且单因素试验得到的结果精度不够，无法取得最佳参数点。

本研究先将结晶母液进行除盐处理，再采用悬浮结晶冷冻浓缩方法对头孢他啶母液进行研究，此方法较渐进冷冻浓缩方式具有能耗低、效率高、提取充分等特点。在单因素试验基础上，利用响应面设计优化头孢他啶母液冷冻浓缩工艺，优化后的工艺可有效提高产品总收率，具有效率高、提取充分等特点，为工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

头孢他啶二盐酸盐(河北金旭药业)；头孢他啶母液(华北制药河北华民药业有限责任公司)；实验室用冷冻浓缩罐(石家庄众泰不锈钢设备制造厂)；1260高效液相色谱仪(美国Agilent)；V20卡尔费休水分仪(美国Mettler Toledo)。

1.2 试验方法

头孢他啶结晶母液制备工艺[12]：将60 g头孢他啶二盐酸盐原料加入90 mL纯化水中，搅拌控温10 ℃，向其中加入4 mol/L氢氧化钠，将pH调至5.60，再用磷酸调节pH至4.5，加入0.06 g头孢他啶，继续用磷酸调pH至3.75，过滤分离头孢他啶晶体后，得到头孢他啶结晶母液，浓度15～20 mg/mL。

除盐母液制备工艺：取头孢他啶母液降温至-5 ℃，用固体氢氧化钠调节pH至5.5，将固液混合物过滤，得到除盐母液。

悬浮结晶冷冻浓缩工艺：将500 mL浓度为15 mg/mL头孢他啶除盐母液泵入到带有夹套的实验室用冷冻浓缩罐，控制冷媒温度，待贴近罐壁的液体开始冷冻后，缓慢转动框式搅拌桨将冻冰层刮下形成细小的冰晶，悬浮的冰晶逐渐长大，冷冻一段时间后，经离心分离出冰相即得到浓缩母液。

渐进冷冻浓缩工艺：在冷冻浓缩反应罐中加入头孢他啶结晶母液，关闭进料阀，开启冷媒进出口阀门，向内盘管通入冷媒，调节反应罐内温度至-5 ℃以下，控制冷冻时间3 h，打开氮气阀门加压，将未冻液体经过滤布层接出即得到头孢他啶冷冻浓缩母液。

浓缩母液套用工艺：使用悬浮结晶冷冻浓缩工艺制备出的浓缩母液替代溶解用的纯化水，其余操作与头孢他啶结晶母液制备工艺过程一致。

图1 工艺流程图Fig.1 Process flowchart

1.3 头孢他啶回收率的测定方法

头孢他啶回收率的计算如下式所示：

(1)

式中，i为头孢他啶回收率;v为除盐母液体积,mL；m为冰晶质量，g;w1为除盐母液含量，mg/mL；w2为冰晶含量，mg/mL。

冰晶质量的测定：将冰晶与浓缩母液离心分离，升温至冰晶完全解冻，称量解冻液的质量；

除盐母液含量的测定：取解冻液，按照《中国药典》二部2015版[13]中头孢他啶含量测定项下色谱条件进样测定，计算样品中所含头孢他啶的浓度；

冰晶含量的测定：取解冻液，方法同除盐母液含量测定。

1.4 试验设计

根据1.2节悬浮结晶冷冻浓缩工艺进行单因素试验，分别确定冷冻温度、冷冻时间、搅拌速率等条件对冰晶质量、冰晶含量的影响。

根据单因素试验结果，采用Design-Expert软件进行响应面设计，以冷冻温度(A)、冷冻时间(B)、搅拌速率(C)为自变量，头孢他啶回收率(Y)为响应值设计试验，各因素及水平见表1。

表1 响应面设计因素及水平Table 1 Factors and levels of the response surface method

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 冷冻温度的影响

根据1.2节悬浮结晶冷冻浓缩工艺进行试验，在冷冻时间2 h，搅拌速率10 r/min条件下，分别设定冷冻温度为-1、-3、-5、-7、-9、-11、-13 ℃，在出现冰晶后开始计时，60 min后冷冻离心，并测定冰相中头孢他啶的含量和冰晶质量。如图2所示，冷冻温度直到降至-5 ℃以下，冰晶质量才明显增多，-5～-13 ℃时增量变缓，且冰晶形成过程夹带部分头孢他啶一同析出，冰晶含量开始升高。因此，选择冷冻温度-5～-7 ℃。

图2 冷冻温度对冰晶含量和冰晶质量的影响Fig.2 Effect of freezing temperature on ice crystal content and quality

2.1.2 冷冻时间的影响

根据1.2节悬浮结晶冷冻浓缩工艺进行试验，在搅拌速率10 r/min、冷冻温度-5 ℃的条件下，分别冷冻30、60、120、180、240 min之后冷冻离心，并测定冰相中头孢他啶的含量和冰晶质量。如图3所示，冰晶质量随冷冻时间延长，逐渐增多，冷冻时间达到180 min后，冰晶形成速度放缓，且冰晶含量明显升高。因此，选择冷冻时间180 min。

图3 冷冻时间对冰晶含量和冰晶质量的影响Fig.3 Effect of freezing time on ice crystal content and quality

2.1.3 搅拌速率的影响

根据1.2节悬浮结晶冷冻浓缩工艺进行试验，在冷冻时间3 h、冷冻温度-5 ℃的条件下，分别设定搅拌速率10、20、30、40 r/min之后冷冻3 h，并测定冰相中头孢他啶的含量和冰晶质量。如图4所示，框式搅拌速率在40 r/min增速的过程中，由于结冰过快导致产品直接包裹在冰块中，速率越快，在搅拌作用下，冰晶颗粒越细小，表面积越大，增加了冰晶与产品分离的难度；另一方面转速过快，消耗功率增加。因此，选择搅拌速率20 r/min。

图4 搅拌速率对对冰晶含量和冰晶质量的影响Fig.4 Effect of stirring rate on ice crystal content and quality

2.2 响应面设计结果及分析

2.2.1 设计方案及结果

根据因素水平设计得出本试验方案及结果(表2)，对表2中的试验数据进行多元回归拟合，可以得到头孢他啶回收率与各因素变量的回归方程模型：

表2 Box-Behnken响应面设计方案及结果Table 2 Scheme and results of the Box-Behnken response surface design

Y=93.11-0.37A+3.19B+0.19C+0.12AB+0.12AC-1.00BC-4.43A2-8.30B2-5.55C2。

2.2.2 响应面方差分析

表3 方差分析Table 3 Results of variance analysis

续表3

2.2.3 响应面的交互分析

利用Design-Expert软件可以得到等高线图和3D响应面图，等高线的形状可以反映两者交互作用的强弱，圆形代表交互作用弱，椭圆形代表交互作用强。

观察图5发现，当搅拌速率不变时，随着冷冻温度降低，回收率先逐渐增大再逐渐减小，当冷冻温度为-7 ℃时，回收率达到峰值；当冷冻温度不变时，随着搅拌速率的增加，回收率先逐渐增大再逐渐减小，当搅拌速率为20 r/min时，回收率达到峰值。根据等高线的形状可知搅拌速率和冷冻时间交互作用最弱。

图5 搅拌速率和冷冻温度对头孢他啶回收率影响的响应面图谱Fig.5 Response surface graphs of the effects of stirring rate and freezing temperature on the recovery of ceftazidime

观察图6发现，当冷冻时间不变时，随着冷冻温度降低，回收率先逐渐增大再逐渐减小。当冷冻温度为-7 ℃时，回收率达到峰值；当冷冻温度不变时，随着冷冻时间的增加，回收率先逐渐增大再逐渐减小，冷冻时间2～3 h时，回收率明显增加，冷冻时间在3～4 h时，回收率变化减缓，当冷冻时间为3 h时，回收率达到峰值。根据等高线的形状可知搅拌速率和冷冻时间交互作用较强。

图6 冷冻时间和冷冻温度对头孢他啶回收率影响的响应面图谱Fig.6 Response surface graphs of the effects of freezing time and temperature on the recovery of ceftazidime

观察图7发现，当搅拌速率不变时，随着冷冻时间增加，回收率先逐渐增大再逐渐减小，冷冻时间2～3 h时，回收率明显增加，冷冻时间在3～4 h时，回收率变化减缓，当冷冻时间为3 h时，回收率达到峰值；当冷冻时间不变时，随着搅拌速率的增加，回收率先逐渐增大再逐渐减小，当搅拌速率为20 r/min时，回收率达到峰值。根据等高线的形状可知搅拌速率和冷冻时间交互作用最强。

图7 搅拌速率和冷冻时间对头孢他啶回收率影响的响应面图谱Fig.7 Response surface graphs of the effects of stirring rate and freezing time on the recovery of ceftazidime

2.3 响应面最优条件的确定及验证

通过Design-Expert软件对试验参数进行拟合预测，得到最佳回收条件：冷冻温度-7.08 ℃、冷冻时间3.19 h、搅拌速率19.99 r/min，预测头孢他啶回收率将达到93.42%。

进一步验证模型方程的适用性与可靠性，结合生产实际可操作性，采用冷冻温度-7 ℃、冷冻时间3 h、搅拌速率20 r/min，进行母液中头孢他啶的回收试验，平行试验3次，结果头孢他啶的平均回收率达到93.15%，与理论值误差为-0.27%，表明拟合模型适用于优化头孢他啶母液回收处理的工艺参数，详见表4。

表4 验证试验结果Table 4 Verification test results

2.4 浓缩母液套用试验

按照1.2节浓缩母液套用工艺进行试验，与现有技术方法套用试验结果做对比。试验1分别是为应用悬浮结晶冷冻浓缩方法未套用和套用制备的样品，试验2分别为应用渐进冷冻浓缩方法未套用和套用制备的样品，试验3分别为应用初始母液进行未套用和套用制备的样品。由表5中试验数据可以看出，应用悬浮结晶冷冻浓缩方法套用制备头孢他啶的整体收率提升明显，由表6中检测结果可以看出，制备的样品质量指标与现有技术基本一致。

表5 对比实验Table 5 Comparative experiment

表6 头孢他啶主要质量指标情况Table 6 Main quality indexes of ceftazidime

3 讨论

本研究采用悬浮结晶冷冻浓缩方法处理头孢他啶母液，在单因素试验基础上通过响应面设计优化冷冻浓缩工艺参数,得出最佳工艺条件为：冷冻温度-7 ℃，冷冻时间3 h，搅拌速率20 r/min。经过验证，优化后工艺参数稳定，头孢他啶回收率达到93.15%，套用质量收率达到92.6%，比未套用母液的质量收率提升约8.3%，比应用渐进冷冻浓缩方法的质量收率提升约0.9%。该工艺操作简单、重复性好，具有实用价值，可为头孢他啶的后续研究提供参考。