射干-麻黄配伍治疗咳嗽变异性哮喘的分子机制探索

梅伟英，陆炜青，陈韫炜，梅文星，申春悌

(常州市中医医院 呼吸科，江苏 常州 213000)

咳嗽变异性哮喘(cough variant asthma，CVA)是以慢性或顽固性咳嗽为特征的呼吸系统常见疾病，其发病机理主要为持续气道高反应性及炎性反应，灰尘、冷空气、油烟等为常见发病诱因，CVA是儿童与成人慢性咳嗽的主要类型[1-2]。目前CVA的临床治疗以支气管扩张剂、糖皮质激素、白三烯受体拮抗剂及扩张支气管平滑肌、改善气道痉挛作用的药物为主，但此类药物长期使用存在毒副作用，且停药后易复发[3]。

中医药治疗注重辨证论治、标本兼治，在改善症状、减轻西药毒副作用、提高生活质量等方面具有独特的优势，在CVA的临床治疗中被逐渐重视。CVA在中医学属“咳嗽”“哮喘”“久咳”等范畴，临床治疗常从祛风涤痰、宣肺化饮等着手。江苏省名中医申春悌教授在中医药治疗肺系疾病方面积累了丰富经验，其临床治疗咳喘常以祛风化痰为法，擅长使用射干、麻黄配伍治疗CVA。中药射干，为鸢尾科植物射干的干燥根茎，味苦性寒，入肺经；麻黄，为麻黄科麻黄属植物的草质茎，性温味辛微苦，入肺与膀胱经。射干、麻黄配伍为《金匮要略》主治寒痰郁肺之咳喘的射干麻黄汤中的君药，“咳而上气，喉中水鸡声，射干麻黄汤主之”，具有温肺化饮、下气祛痰之功效。射干与麻黄在现代咳嗽、哮喘等呼吸系统急性病的中医药治疗中被广泛配伍应用[4]。研究表明，射干、麻黄配伍治疗CVA具有明确疗效[5]，但其药效物质基础、分子机制等目前尚未明确。

本研究拟借助网络药理学方法，立足中医药辨证论治理论，结合申春悌教授临床经验，通过筛选，预测射干、麻黄活性成分治疗CVA的可能作用靶点基因，预测其参与的生物学过程与信号通路，尝试探究其潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 射干-麻黄活性成分筛选及作用靶点预测

通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)分别收集中药射干(Belamcandae Rhizoma)、麻黄(Ephedrae Herba)的活性成分，以中药的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)>30%、类药性(drug like，DL)>0.18为药动学(ADME)筛选条件[6-8]，筛选获得射干、麻黄有效活性成分，并下载相关成分的TCMSP疾病预测靶点。

1.2 CVA靶点基因收集

以“cough variant asthma”为主题词在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)检索目前公认的CVA疾病靶点基因，下载靶点信息进行整理。

1.3 射干-麻黄调控CVA的药物-靶点网络构建

将预测的射干-麻黄有效活性成分作用疾病靶点，与GeneCards获得的CVA疾病靶点导入R软件中，对靶点信息取交集，获得射干-麻黄活性成分直接作用的CVA疾病靶点，并与射干-麻黄有效活性成分共同导入至生物医学网络可视化工具CytoScape软件中，以中药名称、活性成分、CVA靶点为网络节点(Node)，关联关系为边线(Edge)[9]，构建射干-麻黄活性成分调控CVA的药物-靶点网络。

1.4 目标靶点基因蛋白质-蛋白质相互作网络构建分析

将获得的射干-麻黄有效活性成分作用的CVA疾病靶点基因上传至String数据库(https://string-db.org/)，选择物种为人类(Homo Sapiens)，进行靶点基因的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)分析，构建PPI网络。

1.5 目标靶点基因本体与KEGG信号通路富集分析

使用R软件Bioconductor生物医学分析工具包对获得的射干-麻黄有效活性成分作用的CVA疾病靶点基因进行基因本体(gene ontology，GO)[10]和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)[11]信号通路富集分析，并对结果进行可视化，预测目标靶点基因可能参与的生物学功能注释过程与分子信号通路，以p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 射干-麻黄有效活性成分与作用疾病靶点收集

通过TCMSP平台共检索获得射干活性成分56个、麻黄活性成分363个，根据研究设定的OB>30%、DL>0.18药动学标准对射干-麻黄活性成分进行筛选，剔除两药物的共有成分后，获得射干-麻黄有效活性成分30个，预测疾病靶点基因110个，结果如表1所示。

2.2 射干-麻黄调控CVA疾病靶点基因获取

从GeneCards数据库检索获得CVA疾病靶点基因2083个，与上述获得的射干-麻黄有效活性成分作用疾病靶点基因110个进行取交集计算，最终获得射干-麻黄活性成分调控CVA目的靶点基因75个，结果以维恩图呈现，见图1。

图1 射干-麻黄活性成分调控CVA目的靶点基因Fig.1 Venn diagram of the GeneCards cough-variant asthma targets and targets of Belamcandae Rhizomea-Ephedrae Herba couple medicine

2.3 射干-麻黄活性成分-CVA靶点基因调控网络

将2.2节筛选获得的射干-麻黄有效活性成分与其调控的CVA疾病靶点基因信息导入至CytoScape软件中，构建射干-麻黄活性成分-CVA靶点基因调控网络。如图2所示，麻黄、射干与各自有效活性成分及CVA疾病靶点基因通过边线相连接构成网络，靶点基因中PTGS1、NCOA2分别与25、21个射干-麻黄有效活性成分相联系，受到多个活性成分的直接调控作用，为靶点基因中度值(degree)最高的2个基因；中药活性成分中山柰酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)、毛地黄黄酮(luteolin)等与较多CVA靶点基因存在直接联系，可能是射干-麻黄发挥重要药理学作用的主要成分。

2.4 目标靶点基因PPI网络分析

将获得的75个射干-麻黄调控的CVA靶点基因上传至String数据库进行PPI分析，结果如图3所示。75个目标靶点基因编码的蛋白彼此通过边线相连接形成网络，每一条边线代表相应基因编码的蛋白间存在生物学功能互相作用的关系。网络分析结果显示，度值为18.5，局部聚类置信度为0.612，未形成局部聚类，仅形成单一网络聚类。

将String数据库的PPI分析结果下载保存，导入至CytoScape软件重新构建目标靶点基因编码的蛋白之间的PPI网络，使用CytoHubba插件对PPI网络中的节点进行度值计算分析，获得在该网络中度值最高的10个关键蛋白，编码该蛋白的基因则为射干-麻黄活性成分调控CVA的关键基因，结果见图4。CytoHubba从射干-麻黄活性成分调控的75个目标靶点基因中筛选获得了10个关键基因，排名为：IL6、VEGFA、EGFR、CASP3、MAPK8、CCND1、ESR1、MYC、FOS、RELA。

图4 关键基因排名结果Fig.4 Ranking of the hub genes

2.5 目标靶点基因GO与KEGG分析

将获得的射干-麻黄活性成分调控的CVA靶点基因整理，导入至R软件，运行Bioconductor工具包进行GO生物学过程富集分析与KEGG信号通路富集分析。GO富集分析结果显示，75个目标靶点基因共富集于98个具有统计学差异(p<0.05)的GO生物学过程，根据P值从小到大进行排列，主要生物学过程包括核受体活性、直接配体调控序列特异性DNA结合的转录因子活性、泛素样蛋白连接酶结合、甾体激素受体活性、类固醇结合等。KEGG信号通路富集分析结果显示，靶点基因共富集于215条KEGG信号通路，其中110条经检验具有统计学差异(p<0.05)，按照P值从小到大排列，排名前5位的是PI3K-Akt信号通路、肿瘤中的微小RNA、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人类巨细胞病毒感染。分别将GO与KEGG富集分析结果可视化呈现，结果见图5～6。

图5 目标靶点基因GO富集分析Fig.5 Gene ontology enrichment analysis of the target genes

图6 目标靶点基因KEGG富集分析Fig.6 Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment analysis of the target genes

3 讨论

CVA常因冷空气、灰尘等因素诱发，导致患者出现持续或阵发性的干咳，难以停止。儿童CVA治疗不当、不及时可能进一步发展为典型哮喘发作，CVA严重影响患者的日常生活质量。中医药治疗立足整体观念与辨证论治，具有简便廉验的特点，在CVA的临床治疗中与西药配合，能够发挥出良好的功效。

本研究立足于射干-麻黄配伍辨证治疗CVA，借助网络药理学与生物信息学理论方法及在线分析工具，对其有效活性成分调控CVA疾病靶点基因的关系网络及潜在分子机制展开探索。首先根据中药口服生物利用度、类药性等药动学原则，从TCMSP平台筛选获得射干-麻黄有效活性成分30个，对应不同疾病靶点110个；从GeneCards疾病靶点数据库筛选获得CVA的疾病靶点基因，经过取交集处理得到射干-麻黄活性成分可能产生直接调控作用的CVA疾病靶点基因75个；将上述获得的射干-麻黄有效活性成分与目标靶点基因进行调控网络关系构建分析。从网络中可知，射干-麻黄的多个不同有效活性成分分别与多个不同的CVA靶点基因相联系，而同一个靶点亦可能同时受到多个不同活性成分的作用，提示射干-麻黄治疗CVA的多成分、多靶点、网络调控特点。

靶点基因是药物活性成分发挥调控作用的关键对象。从目标靶点基因编码蛋白的PPI网络关系可见，获得的75个目标靶点基因彼此均存在密切联系，网络中无分散的聚类产生，平均每个靶点基因的度值为18.5，提示彼此之间平均与18个以上的不同靶点基因相联系，共同发挥重要的生物学功能作用。进一步通过CytoHubba插件分析计算PPI网络中基因的度值大小，筛选出网络中度值最高的10个关键基因。靶点基因中C反应蛋白(CRP)、花生四烯酸5-脂加氧酶(ALOX5)、关键基因白介素6(IL6)等是已经发现的重要炎症因子，在大量相关炎症反应中被广泛研究；关键基因血管内皮生长因子(VEGFA)、表皮生长因子受体(EGFR)等广泛参与气道重塑并与炎症细胞的募集相关；关键基因雌激素受体1(ESR1)、核受体辅活化子2(NCOA2)等则是参与多种受体激活活动反应的重要因子。靶点基因彼此联系，在不同的信号通路中发挥独特的生物学功能。射干-麻黄有效活性成分可能通过调控CVA目标靶点基因，发挥对多个与CVA发病病理机制相关的信号通路的介导调控作用，从而达到治疗的目的。

从目标靶点基因的GO生物学过程、KEGG信号通路富集分析结果来看，射干-麻黄活性成分调控的75个CVA靶点基因共富集于98个生物学过程、110条信号通路，涉及气道炎症反应与气道高反应性调控、自身免疫反应、病毒感染、类固醇激素受体结合活动等CVA病理与治疗相关过程。气道炎症反应与气道高反应性是CVA发病的重要环节，CRP、IL6等炎症因子水平在CVA发病中显著升高，糖皮质激素对气道局部炎症反应的抑制作用显效明显[12]，射干-麻黄配伍的方剂治疗CVA研究中发现CRP、IL4等炎症因子水平明显下降[13]，靶点基因富集于类固醇结合、甾体激素活性等过程，提示射干-麻黄有效活性成分可能通过调控IL3、IL6等炎症因子信号通路发挥抑制局部炎症、发挥类糖皮质激素作用。目前临床常以β受体激动剂、白三烯受体拮抗剂等药物扩张支气管平滑肌、缓解气道痉挛治疗CVA，研究表明麻黄碱等成分可能通过ALOX5等靶点基因参与的白三烯受体相关通路调节内质网应激反应以减轻气道反应性[14-15]。机体免疫调节是CVA发病的另一个关键点，有研究认为类似过敏反应为机体免疫功能的异常表现，目的靶点基因富集于CD8+T细胞调节通路、自身免疫系统等信号通路，提示射干-麻黄活性成分可能通过调节机体免疫反应调控CVA的病理发生，亦有研究表明麻黄成分可改善机体免疫功能[16]。疱疹病毒、巨细胞病毒等感染是呼吸系统疾病的常见病因，病毒感染可诱发机体免疫反应及炎症反应，不少CVA反复发作的病因即为呼吸系统的慢性病毒感染所致[17]，射干-麻黄活性成分参与调控病毒感染相关相号通路，可能是CVA病理机制研究的新方向。

综上所述，本研究运用网络药理学理论方法，揭示了射干-麻黄配伍治疗CVA潜在的有效活性成分-疾病靶点调控网络，并预测目标靶点基因可能参与的相关生物学过程与信号通路。研究结果提示射干-麻黄治疗CVA存在多成分、多靶点、多信号通路、多生物学过程的复杂网络调控机制特点，提出射干-麻黄可能通过抑制气道炎症反应与高反应性、调节自身免疫功能、干预病毒感染活动等环节发挥治疗作用的观点，希望能为后续具体实验研究提供方向。