猪囊尾蚴病患者血清与猪源囊虫虫体蛋白Label-free定性蛋白质组学研究

刘书婷，杨立娟,蔡亚南，王 丹，杨小洁，赵 权，张 媛

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118)

猪囊尾蚴病(Cysticercoids cellulosae)是由猪带绦虫(Taeniasodium)的幼虫寄生在人或猪等宿主体内而引起的一种重要人兽共患寄生虫病，寄生在各组织器官和横纹肌，主要是脑和肌肉中。现代医学可通过电子计算机断层扫描(Computed tomography,CT)和核磁共振(Magnetic resonance imaging,MRI)对猪囊尾蚴病进行诊断，但二者不仅成本较高、乡村可用性低，而且未成囊的感染前期无法被诊断，最终还需通过获取节片或虫卵确诊。

现代医学诊断技术在猪囊尾蚴病的快速诊断中存在局限性，当前需要筛选有效特异性抗原或抗体建立诊断方法。孙树汉等[1]通过探针筛选出4个 特异性抗原基因，景志忠等[2]首次成功从构建的六钩蚴(Oncosphere)文库中筛选出TsO1基因，Robles等[3]从猪带绦虫噬菌体展示文库分离的2个可用的候选抗原基因均具有一定的特异性和灵敏度，但与其他类似寄生虫有较多的交叉反应，使特异性检测方法的建立陷入较大的困难。目前寄生虫蛋白组学方法筛选抗原逐渐成熟，可利用新的蛋白组学方法筛选猪囊尾蚴的特异性蛋白。

蛋白组学技术对蛋白质的定量与定性有重要意义[4]。蛋白质组学定量技术包括标记定量蛋白质组学和无标记(Label-free)定量蛋白质组学[5]。Label-free 相对于标记定量蛋白质组学，具有无需标记、耗费低、操作简单、样本广泛和检测灵敏度高等优点[6]，逐步应用在寄生虫引起相关疾病的研究中。Label-free 定量蛋白质组学虽被广泛应用于研究机体生理功能调节蛋白质[6]，但在研究猪囊尾蚴方面使用该技术却鲜有报道，因此本试验利用 Label-free 技术对患者血清和囊虫虫体的全蛋白进行蛋白质组学研究。本试验对猪囊尾蚴病患者血清和虫体的蛋白进行胰酶酶解，通过液相色谱串联质谱(Liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS/MS)对猪囊尾蚴患者血清和虫体进行蛋白组学研究和分析，以期寻找到患者感染囊虫病后与囊虫相关的关键蛋白，并阐明寄生机制和构建灵敏度高、特异性强的诊断方法，最终为猪囊尾蚴病的诊断提供新的依据和思路。

1 材料与方法

1.1 材料与样品来源

1.1.1 材料与试剂 BCA试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司。

1.1.2 患者血清和虫株来源 患者血清由吉林农业大学校医院提供，经CT或MRT确诊的肌肉囊尾蚴病患者和脑囊尾蚴病患者共18例。猪源虫株由吉林农业大学动物科学技术学院寄生虫实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取和肽段酶解 样品从-80 ℃取出，4 ℃，12 000 g离心10 min，去除细胞碎片，上清转移至新的离心管，用Thermo公司生产的试剂盒参照PierceTMTop12 Abundant Protein Depletion Spin Columns Kit说明书去除高丰度蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白浓度。将提取的蛋白通过胰酶酶解，对酶解后的蛋白进行高效液相色谱(HPLC)分级、液相色谱-质谱串联分析，进行后续操作。

1.2.2 功能预测 通过基因本体论(GO，http://www.geneontology.org/)[7]、京都基因和基因组百科全书(KEGG，http://www.genome.jp/kegg/)[8-9]和同源基团簇(COG，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cog/)[10]3个数据库对蛋白注释、预测基因和蛋白质的功能。费舍尔精确测试，然后进行FDR校正[11]，以确定明显丰富的围棋条件或路径。以FDR校正，P<0.05作为明显富集的阈值。

1.3 伦理批准和患者知情同意 本研究不涉及伦理批准，患者知晓并同意血清蛋白分析。

2 结果

2.1 蛋白鉴定及质谱检测 本试验中，通过质谱分析共得到426 795张二级谱图。质谱二级谱图经蛋白理论数据搜库后，得到可利用有效谱图数为38 163，谱图解析共鉴定到13 347条肽段，其中特异性肽段为8 900。其中3次重复试验一共鉴定到血清中有595个蛋白，囊虫有63个蛋白，见表1。

表1 质谱数据结果基本统计Table1 Basic statistics of MS results

通过液相色谱-质谱联用分析患者血清和囊虫蛋白，韦恩图展示二者各自的生物学重复交集，患者血清的蛋白交集为323个，囊虫的蛋白交集为4个，3次重复试验满足生物学重复，见图1。患者血清和囊虫的交叉蛋白为1个，见图2。患者血清和囊虫蛋白的平均分子量大小都集中分布在10～110 kDa。

图1 蛋白质组韦恩图Fig.1 Wayne diagram of proteomeA：囊虫组的韦恩图；B：患者血清组的韦恩图A:Wayne diagram of Cysticercosis group;B:Wayne diagram of patient serum group

图2 猪源囊虫和患者血清交叉蛋白韦恩图Fig.2 Wayne diagram of cross proteins of porcine Cysticercosis and patients’serumA：囊虫；B：患者血清;1:A0A0R3X5M7A:Cysticercosis;B:Patient serum1：A0A0R3X5M7

2.2 生物信息学分析

2.2.1 GO分析 按照生物过程(Biological process，BP)、细胞组成(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)三类从不同角度注释蛋白。GO分析显示，患者血清蛋白主要参与15种BP，其中478个蛋白参与细胞内进程，474个蛋白参与单一生物体系进程，432个蛋白参与生物学调节，其他参与代谢等进程；主要具有8种CC，489个蛋白来自细胞器内，484个蛋白分布于细胞内，437个蛋白则在细胞外区，其他分布于大分子复合物等内；有8种分子功能，517个蛋白参与结合功能，217个蛋白参与催化功能，74个蛋白有分子调节剂功能，其他蛋白有参与信号转导活动等功能。囊虫蛋白主要参与8种BP,其中20个蛋白参与细胞内进程，16个蛋白参与代谢进程，11个蛋白参与单一生物体系进程，其他蛋白参与生物学调节等进程；其有6种CC，16个蛋白位于细胞内，14蛋白分布在大分子复合物中，13个蛋白分布在细胞器中；其具有7种分子功能，25个蛋白具有结合功能，12个蛋白有催化功能，2个蛋白有转运活性，其他蛋白参与信号转导活动等。

2.2.2 COG分析 患者血清所有鉴定的蛋白质被分为22个COG簇，包括 O(翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣，Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)、R(仅限一般功能预测,General function prediction only)、T(信号转导机制，Signal transduction mechanisms)，其中“翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣簇”的匹配蛋白在所有COG中所占比例最大；囊虫所鉴定的蛋白质被分为16个COG簇，包括：T、O、K(转录,Transcription)，其“信号转导机制簇”匹配蛋白在所有KOG中所占比例最大。

2.2.3 KEGG分析 通过费舍尔检验法对患者血清进行KEGG分析(其只能检测到患者血清的功能)，并计算q值，见中插彩版图3。患者血清蛋白主要富集在补体与凝血级联(Complement and coagulation)，ECM受体相互作用(ECM-receptor interaction)，类似金黄色葡萄球菌感染(Staphylococcusaureusinfection)相关的生物学通路、同样涉及免疫相关的通路：PI3K-Akt信号通路、细胞黏附分子(Cams)等关键通路。

图3 鉴定到血清蛋白在KEGG通路中富集分布气泡图Fig.3 KEGG pathway enrichment bubble plot of identified serum protein

2.2.4 蛋白结构域富集 鉴定到的蛋白结构域通常在25～500个氨基酸长度，基于蛋白保守结构域预测，对所有囊虫蛋白在Uniprot数据库比对，寻找极为保守的结构域，亲缘关系较远的种属中 Histone H2A、H2B、H3的基因和Histone-fold结构域非常保守。对Histone H2A、H2B、H3与Histone-fold结构域进行费舍尔检验并FDR校正P值后，计算q值，绘出气泡图，见中插彩版图4。结构域Histone H2A、H2B、H3以及Histone-fold结构域P值最低，同时是涉及蛋白数量最多的2个结构域。

图4 鉴定到囊虫蛋白在蛋白结构域分类中富集分布气泡图Fig.4 Protein domain enrichment bubble plot of identfied Cysticercus protein

2.3 猪源囊虫和猪囊尾蚴病患者血清的交叉蛋白 通过高效液相色谱-串联质谱系统鉴定分析，猪源囊虫与患者血清有1个交叉蛋白，即A0A0R3X5M7蛋白。通过亚细胞定位发现该蛋白位于细胞核内,主要存在于翻译后修饰、蛋白质转换、伴侣簇中，是SWI/SNF复合物中依赖性ATP的染色体重塑复合物。

3 讨论

人感染猪囊尾蚴病主要通过免疫反应和炎症反应对侵入机体的寄生虫进行防御，囊尾蚴虫在感染宿主过程中，为适应不同宿主的寄生环境，其向宿主释放一系列的分泌物来改变自身及周围条件，必然改变宿主蛋白质的表达或改变蛋白质的相互作用，这些蛋白的改变则能够反应患病的状态，逃避宿主的免疫反应[12]。虫体对环境变化敏感，猪囊尾蚴虫体中分泌型蛋白与患者血清中分泌型蛋白存在相互作用，通过参与代谢、生物学调节等进程，间接调节宿主感染寄生虫的相关免疫反应。

本试验对患者血清和囊虫样本全蛋白进行Label-free定性分析，通过KEGG的富集分析，发现囊虫分泌的蛋白主要影响补体与凝血级联反应。通过结构域富集预测，发现囊虫与进缘物种中的其他绦虫属物种高度保守。

补体系统作为宿主一种重要的生物学作用的效应系统和效应放大系统，广泛参与机体免疫调节也可以介导免疫溶菌和溶血作用，同时也是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁[13]。动物患病时其总补体含量或单一补体分子含量可发生改变，因此对体液中补体水平的测定，对疫病的诊断具有一定意义[13]。猪囊尾蚴患者机体的补体系统在不同感染状态下以不同的途径被全面的激活，说明在天然防御系统中，特别是在感染的早期，补体系统起着重要的作用。总之，补体凝血系统在猪囊尾蚴感染过程当中是一个极其复杂的过程，本试验仅仅是说明了这一现象，其中涉及的机理需要进一步的探索。

组蛋白的基因非常保守。亲缘关系较远的种属中，4种组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)氨基酸序列都非常相似，染色质中的组蛋白与DNA的含量之比为1∶1。染色质是由许多核小体组成的，H2A、H2B、H3和H4各2个分子构成的8聚体是核小体的核心部分，不同生物的H1序列变化较大，H1的作用是与线性DNA结合以帮助后者形成高级结构。组蛋白是已知蛋白质中最保守的。结构域富集预测结果验证了囊虫外分泌蛋白的高度保守性。蛋白A0A0R3X5M7是SWI/SNF复合物中依赖性ATP的染色体重塑复合物,在真核生物中高度保守。因此打破囊尾蚴病目前的困境，可以避免与其他类似寄生虫的交叉反应。通过Lable-free方法为筛选特异性诊断标识提供便捷[15]。

综上所述，本试验结合蛋白质组学获取了囊虫的分泌产物，试验数据显示了猪囊尾蚴病患者感染后，主要与补体和凝血系统有关。本试验提供了新的角度来认识猪囊尾蚴病，从血清中可以检测到属于囊虫分泌的相关蛋白，表明囊虫的分泌产物可能对宿主有直接的靶向作用。试验中筛选出的蛋白A0A0R3X5M7为从囊虫病患者中检测出的囊虫外分泌蛋白，可以作为解决猪囊尾蚴病不同感染发育时期的诊断标识蛋白。预测的囊虫蛋白保守结构域主要为Histone H2A、H2B、H3和Histone-fold。本试验为进一步研究囊尾蚴寄生和特异性抗原诊断标识提供参考依据及思路，为囊尾蚴虫与宿主之间的相互关系及演变规律提供了基础数据，以期为猪囊尾蚴的临床诊断提供一定的客观依据，服务于我国猪囊尾蚴病的防控。