钩吻素己对NMDA受体的抑制作用

彭凌峰,杨 杰,孙志良

(1.湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410125；2.湖南省兽药工程技术研究中心，湖南 长沙 410125；3.湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410125)

精神疾病在医学领域的研究备受关注。喹啉酸是色氨酸的代谢物，是N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受体内源性激动剂和递质候选物。大脑中随着喹啉酸浓度的升高，NMDA受体兴奋性增加而导致阿兹海默症、自闭症、精神分裂等精神疾病[1-2]。同时NMDA受体与神经性疼痛传导也有关[3]。NMDA受体分为NMDA1型(NR1)和NMDA2型(NR2)，NMDA1型是构成离子通道的基本单位，NMDA2型是调节单位。而NMDA2型又分为2A、2B、2C、2D四种亚型。其中N-甲基-D-天冬氨酸ζ1(N-methyl-D-aspartic acid receptor ζ1，NMDAζ1)属于NMDA1，N-甲基-D-天冬氨酸ε2(N-methyl-D-aspartic acid receptor ε2，NMDAε2)为NMDA2B。

应用NMDA受体治疗精神疾病的化学药物有很多，例如：非氨酯(Felbamate)、地佐环平(Dizocilpine)、氯胺酮、盐酸普鲁卡因、L-701324等。这些化学药物在治疗精神疾病的同时，往往伴随着不良反应的发生。研究发现，中草药有效功能成分在治疗精神疾病方面副作用小，效果好。中草药功能成分在精神疾病方面的研究和应用受到越来越多的关注[4]。

钩吻是一种草本植物，具有许多药理作用,如抗炎、抗焦虑、镇痛、抗肿瘤、促生长等[5-6]。钩吻醇提物中有多种生物碱，其中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻绿碱具有明显的抗焦虑的能力[7]，钩吻素己能有效减轻神经性疼痛和炎症性疼痛[8]。钩吻素己减轻疼痛的机制尚未清楚，本试验研究钩吻素己对NMDA受体的抑制作用，为探究钩吻素己减轻疼痛的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 胎牛血清(FBS)，购自南京森贝伽生物科技有限公司；高糖培养基(DMEM)，购自美国Thermo Fisher公司；高效RIPA裂解液[RIPA buffer(high)]、噻唑蓝(MTT),均购自北京Solarbio公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度检测试剂盒，购自康为世纪公司；蛋白一抗：NMDAζ1、p-NMDAζ1(Ser896)、NMDAε2、p-NMDAε2(Tyr1474)、β-actin和相应二抗，均购自Abbkine公司；ECL超敏化学发光显影液，购自Proteintech公司；5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU)细胞增殖检测试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 主要药物 标准品钩吻素己(Gelsenicine，纯度≥ 98%)，购自成都曼斯特生物科技有限公司；标准品喹啉酸(Quinolinic acid，纯度≥ 99%)、地佐环平(Dizocilpine，纯度≥ 99%)，均购自美国Abmole公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 Neuro-2a小鼠神经母瘤细胞，购自上海百慷生物技术股份有限公司。取Neuro-2a细胞用含有10% FBS的完全培养基于细胞培养箱中培养。待细胞生长至对数期时进行消化、传代。

1.3.2 MTT检测Neuro-2a细胞活性 取对数生长期的Neuro-2a细胞制备细胞悬液，浓度为5 × 104个/mL，每孔100 μL接种于96孔板。组一中添加钩吻素己(浓度为1 600、800、400、200、100、50、25、12.5 μmol/L和6.25 μmol/L)，对照组加入培养基。组二中添加喹啉酸(浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L和1.563 μmol/L)，对照组加入培养基。组三中添加喹啉酸(15 μmol/L)+钩吻素己(浓度为400、200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L和3.125 μmol/L)，对照组为喹啉酸(15 μmol/L)。组四中添加喹啉酸(15 μmol/L)+地佐环平(浓度为400、200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L和3.125 μmol/L)，对照组为喹啉酸(15 μmol/L)。组一、组二和组四药物作用24 h，组三药物作用12、24 h和48 h。所有试验组药物作用一定时间后，每孔加入MTT溶液，37 ℃孵育4 h。随后加入二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，用酶标仪测定吸光值(A)。计算细胞活力度，每组试验均重复3次(n=3)。

1.3.3 EdU细胞增殖检测 取对数生长期的Neuro-2a细胞制备细胞悬液，浓度为5 × 104个/mL，接种在96孔板中。待细胞贴壁后，加入药物孵育。组一中添加钩吻素己(浓度为0、100 μmol/L和200 μmol/L)。组二中添加喹啉酸(15 μmol/L)+钩吻素己(浓度为0、100 μmol/L和200 μmol/L)。组三中添加喹啉酸(15 μmol/L)+地佐环平(浓度为0、25 μmol/L和50 μmol/L)。药物孵育24 h后，加入等体积EdU工作液继续孵育2 h。然后经过固定、洗涤、通透、洗涤后，加入Click反应液避光孵育30 min。洗涤后加入1×Hoechst 33342溶液，孵育10 min。洗涤后进行荧光检测[9]。使用Image J软件进行荧光信号强度(MFI)检测，然后计算EdU阳性细胞比例即为细胞增殖率。每组试验均重复3次(n=3)。

1.3.4 蛋白免疫印迹法检测相关蛋白表达 取对数生长期的Neuro-2a细胞制备细胞悬液，浓度为10×104个/mL。组一为钩吻素己(浓度为0、50、100 μmol/L和200 μmol/L)、组二为喹啉酸(浓度为0、10 μmol/L和15 μmol/L)、组三为喹啉酸(15 μmol/L)+钩吻素己(浓度为0、50、100 μmol/L和200 μmol/L)、组四为喹啉酸(15 μmol/L)+地佐环平(浓度为0、25 μmol/L和50 μmol/L)。药物作用24 h后，提取细胞蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，蛋白转至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene flouride，PVDF)膜上。封闭液封闭1 h，加入稀释好的NMDAζ1、p-NMDAζ1(Ser896)、NMDAε2、p-NMDAε2(Tyr1474)和β-actin(比例均为1∶500)一抗，4 ℃孵育过夜。用吐温20/三乙醇胺缓冲盐水溶液(Tween20/Tris-buffered saline，TBST)清洗PVDF膜后，加入稀释好的二抗(比例为1∶10 000)。室温摇动孵育2 h后，用TBST缓冲液清洗。将膜置于化学发光成像系统中，均匀滴加ECL化学发光显影液，避光孵育2 min后开始显影。每组试验均重复3次(n=3)。

2 结果

2.1 MTT检测Neuro-2a细胞活性 钩吻素己和喹啉酸分别作用Neuro-2a细胞24 h后，钩吻素己在100～800 μmol/L时可增强细胞活力，其中100 μmol/L的效果最好(P<0.05)。结果表明钩吻素己对Neuro-2a细胞的半抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration，IC50)远远大于1 600 μmol/L(图1A)，而喹啉酸对Neuro-2a细胞的IC50为15 μmol/L(图1B)。

图1 钩吻素己(A)和喹啉酸(B)对Neuro-2a细胞活性的影响Fig.1 Effect of gelsenicine(A)and quinolinic acid(B)on the viability of Neuro-2a cells与对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，n=3；下图同Compare to control group,*：P<0.05,**：P<0.01,***：P<0.001,n=3.The same as below

钩吻素己(400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L和0 μmol/L)和15 μmol/L喹啉酸共处理细胞12 h(图2A)、24 h(图2B)、48 h(图2C)，结果显示钩吻素己能有效减弱喹啉酸对于细胞活性的抑制作用。当钩吻素己浓度为200 μmol/L时，与对照组(0 μmol/L)比较，细胞活力度增加10%(P<0.01)(图2B)。地佐环平是NMDA受体的一种非竞争性拮抗剂。不同浓度的地佐环平和喹啉酸同时作用细胞24 h后，结果显示地佐环平对细胞具有保护效果。当地佐环平作用浓度为50 μmol/L时，与对照组(0 μmol/L)相比，细胞活力度提高了10%(P<0.05)(图2D)。

图2 钩吻素己、地佐环平对喹啉酸处理的Neuro-2a细胞活力影响Fig.2 Effect of gelsenicine and dizocilpine on the viability of quinolinic acid-treated Neuro-2a cellsA：钩吻素己和喹啉酸处理12 h；B：钩吻素己和喹啉酸处理24 h；C：钩吻素己和喹啉酸处理48 h；D：地佐环平和喹啉酸处理24 hA:Gelsenicine and quinolinic acid treated for 12 h;B:Gelsenicine and quinolinic acid treated for 24 h;C:Gelsenicine and quinolinic acid treated for 48 h;D:Dizocilpine and quinolinic acid treated for 24 h

2.2 EdU检验钩吻素己对细胞增殖的影响 EdU试验检测钩吻素己作用细胞24 h后，细胞增殖情况。200 μmol/L钩吻素己作用Neuro-2a细胞24 h后，EdU阳性细胞比例增加(P<0.05)(中插彩版图3B)，即Neuro-2a细胞增殖率增加，说明钩吻素己能够促进Neuro-2a细胞增殖。

图3 钩吻素己对Neuro-2a细胞增殖的影响Fig.3 Effect of gelsenicine treatment on the proliferation of Neuro-2a cellsA：荧光显微镜观察结果(100 ×)；B：EdU阳性细胞比例分析统计A:Fluorescence microscope observe result(100 ×);B:EdU positive cells rate analysis and statistics

2.3 EdU检验钩吻素己、地佐环平对喹啉酸作用下的细胞增殖影响 100 μmol/L钩吻素己+15 μmol/L喹啉酸试验组中EdU阳性细胞比例明显增加(P<0.05)(中插彩版图4C)。50 μmol/L地佐环平+15 μmol/L喹啉酸试验组中EdU阳性细胞比例略有增加(P>0.05)(中插彩版图4D)。结果表明钩吻素己明显降低了喹啉酸抑制Neuro-2a细胞增殖的能力。

图4 钩吻素己、地佐环平对喹啉酸处理Neuro-2a细胞增殖的影响(100×)Fig.4 Effect of gelsenicine and dizocilpine on the proliferation of quinolinic acid-treated Neuro-2a cells (100 ×)A:钩吻素己+喹啉酸组荧光显微镜观察结果；B:地佐环平+喹啉酸组荧光显微镜观察结果；C:钩吻素己+喹啉酸组EdU阳性细胞比例；D:地佐环平+喹啉酸组EdU阳性细胞比例A:Fluorescence microscope observe result of gelsenicine + quinolinic acid group;B:Fluorescence microscope observe result of dizocilpine + quinolinic acid group;C:EdU positive cells rate of gelsenicine + quinolinic acid group;D:Edu positive cells rate of dizocilpine + quinolinic acid group

2.4 Western Blot检测钩吻素己对NMDA受体的影响 结果显示，钩吻素己能降低p-NMDAε2(Tyr1474)水平和NMDAε2蛋白的表达(P<0.05)，表明钩吻素己能够抑制NMDAε2受体活性。如图5所示，当钩吻素己浓度为200 μmol/L时，NMDAζ1蛋白表达量和对照组(0 μmol/L)相比基本没有变化(P>0.05)，但是降低了p-NMDAζ1(Ser896)水平(P<0.001)，使得NMDAζ1蛋白活性降低。表明钩吻素己能够有效抑制NMDA受体活性。

图5 钩吻素己对NMDAζ1和NMDAε2蛋白表达及其磷酸化作用的影响Fig.5 Effect of gelsenicine on protein expression and phosphorylation of NMDAζ1 and NMDAε2A：蛋白灰度条带；B：蛋白表达分析统计A:Protein grayscale band;B:Protein expression analysis and statistics

2.5 Western Blot检测钩吻素己、喹啉酸对NMDA受体的影响 结果显示，喹啉酸提高了p-NMDAε2(Tyr1474)水平(P<0.05)，NMDAε2蛋白活性增加。同时引起p-NMDAζ1(Ser896)水平增加(P<0.05)，增加NMDAζ1蛋白活性(图6A)。钩吻素己能够抑制喹啉酸引起的p-NMDAε2(Tyr1474)水平增加，p-NMDAε2(Tyr1474)水平随钩吻素己浓度的增加而降低(P<0.05)。当钩吻素己浓度达到200 μmol/L时，p-NMDAε2(Tyr1474)水平明显减少(P<0.01)，NMDAε2表达量明显受抑制。NMDAε2蛋白表达量随钩吻素己浓度的增加而减少，p-NMDAζ1(Ser896)水平和NMDAζ1蛋白表达量也相应减少(P<0.05)(图6B)。25 μmol/L地佐环平和15 μmol/L喹啉酸同时作用Neuro-2a细胞时，p-NMDAε2(Tyr1474)水平降低(P<0.05)，而NMDAε2表达量基本没有变化。同时p-NMDAζ1(Ser896)水平也相应的减少(P<0.01)，但NMDAζ1蛋白的表达量相对基本不变，NMDAζ1蛋白活性降低(图6C)。

图6 钩吻素己和地佐环平对喹啉酸处理的Neuro-2a细胞中NMDAζ1和NMDAε2蛋白表达及其磷酸化作用的影响Fig.6 Effect of gelsenicine and dizocilpine on protein expression and phosphorylation of NMDAζ1 and NMDAε2 in quinolinic acid-treated Neuro-2a cellsA:喹啉酸组蛋白灰度条带；B:钩吻素己+喹啉酸组蛋白灰度条带；C:地佐环平+喹啉酸组蛋白灰度条带;D:喹啉酸组蛋白表达分析统计；E:钩吻素己+喹啉酸组蛋白表达分析统计；F:地佐环平+喹啉酸组蛋白表达分析统计A:Protein grayscale band of quinolinic acid group;B:Protein grayscale band of gelsenicine + quinolinic acid group;C:Protein grayscale band of dizocilpine + quinolinic acid group;D:Protein expression analysis and statistics of quinolinic acid group;E:Protein expression analysis and statistics of gelsenicine + quinolinic acid group;F:Protein expression analysis and statistics of dizocilpine + quinolinic acid goup

3 讨论

疼痛等神经信号的传递，往往伴随着神经递质在受体间的传递。喹啉酸是NMDA受体内源性激动剂，它对于神经细胞的毒性主要通过激动NMDA受体，使细胞外Ca2+大量进入细胞内，引起神经细胞内外电位发生变化。Ca2+使细胞内电荷过载以此激活细胞内的凋亡基因，引发细胞的凋亡[10-11]。本试验结果表明，钩吻素己对Neuro-2a细胞正常生长几乎没有毒性；当钩吻素己和喹啉酸同时加入时，钩吻素己能保护Neuro-2a细胞，拮抗喹啉酸毒性效果。

NMDAε2(即NR2B)是NMDA2受体多种亚型中的一种，有多样性调节功能。NMDAε2受体与抑郁、记忆障碍和缺陷、神经性运动等相关[12]，也是神经性疼痛的参与者，在脊髓水平上对神经性疼痛的发展起重要作用[13]。试验结果显示，钩吻素己能够有效减少NMDAε2蛋白的表达，降低p-NMDAε2(Tyr1474)水平。同时降低p-NMDAζ1(Ser896)水平，有效抑制NMDAζ1受体活性。钩吻素己的镇痛效果，可能是通过降低p-NMDAε2(Tyr1474)水平和NMDAε2蛋白表达来调控NMDAζ1受体，降低NMDAζ1活性，减少细胞膜内外离子的进出，进而减弱膜内外电荷转变引起的电信号传递。预示着NMDAε2受体可能是钩吻素己另外一种潜在的镇痛途径。

钩吻素己是中草药单体成份，在机体内代谢快，不易产生长期用药后的依赖性[14]。地佐环平作为一种精神类药物，也是NMDA受体的一种拮抗剂，在治疗抑郁和止痛等病症中发挥作用[15]。由于喹啉酸是NMDA受体一种内源性激动剂和递质候选物质，而地佐环平作为一种精神类药物。本试验选择地佐环平作为一种阳性对照药物，研究钩吻素己对NMDA受体的影响。地佐环平能有效降低NMDAζ1活性，但不影响NMDAζ1蛋白表达[16]。钩吻素己能降低p-NMDAζ1(Ser896)和p-NMDAε2(Tyr1474)水平，但NMDAζ1蛋白表达量无明显变化。在喹啉酸作用下，钩吻素己能够降低NMDAε2蛋白表达，而地佐环平不能。地佐环平与喹啉酸同时作用时，NMDAζ1蛋白表达不会减少，但钩吻素己与喹啉酸同时作用能引起NMDAζ1蛋白表达减少。钩吻素己和地佐环平都能有效的降低NMDAζ1和NMDAε2两种蛋白的活性。

钩吻素己能够通过降低p-NMDAε2(Tyr1474)水平抑制NMDAε2蛋白活性，以及抑制NMDA受体中NMDAζ1蛋白活性。通过抑制NMDA受体活性，有效降低喹啉酸对Neuro-2a细胞的活性抑制，促进细胞增殖。预示着钩吻素己可能成为一种有效拮抗NMDA受体蛋白活性的潜在前体类药物。

钩吻素己能够有效抑制NMDA受体活性，但是钩吻素己作用于NMDA受体是竞争性抑制和非竞争性抑制并没有得到有效的验证，这需要未来进一步试验研究。