雷竹内生真菌分离及其功能性菌株筛选与鉴定

杨 滢，楼玫娟，李子林，陈 静，吴 斐，黄晓宇，郭春兰，张林平*

（1. 江西农业大学 鄱阳湖流域森林生态系统保护与修复国家林业和草原局重点实验室, 江西 南昌 330045；2. 江西省资溪县森林病虫害防治检疫站, 江西 资溪 335300；3. 九连山国家级自然保护区管理局，江西 龙南 341702）

【研究意义】雷竹（Phyllostachys praecoxf.prevelnalis）属禾本科，是我国特有的优良笋用竹[1]。但是，随着种植面积的不断扩大，连年的覆被和不科学的施肥导致雷竹种植区大面积的竹林林地土壤退化越来越严重[2]。植物内生菌是指对植物来说不会造成明显病害，且在其整个生长发育阶段的某一阶段生活在植物组织内的一类微生物，主要包括内生真菌、内生细菌、内生放线菌[3]。【前人研究进展】近年来，植物内生菌作为潜在的外源基因载体和生防资源，在医学领域、农业生产领域中发挥着重要作用[4]。内生真菌与寄主植物互惠共生，同时也会产生次生代谢产物[5]，其主要活性成分有抗肿瘤活性[6-7]、抑菌活性[8-9]、抗氧化活性[10-12]和抗病毒活性[13-15]等。从禾本科植物分离得到的内生真菌种类繁多，一般情况下，所属地区不同，内生真菌的种类也不同，具有较为明显的差异，植物不同部位之间多样性差异也较为明显[16-17]。同时，大量研究发现，内生真菌与禾本科宿主植物之间的互作有助于宿主植物抵抗病原菌，提高适应生存环境的能力[18-19]。【本研究切入点】本研究以植物内生菌为切入点，明确雷竹内生真菌资源，探究内生真菌的功能性。【拟解决的关键问题】雷竹集约化经营过程中存在有机覆盖物难降解、土壤退化严重、雷竹病害区域发生严重等问题，探究雷竹根系中是否存在多功能性内生真菌，并通过微生物途径解决上述关键问题。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1样品及供试病原菌雷竹根部样品于2019年7月采自江西省林业科学院竹子园；油茶炭疽病菌（Colletotrichum camelliae）、猕猴桃果腐病菌（Neofabraea actinidiae）、毛竹枯梢病菌（Ceratosphaeria phyllostachydis）等供试病原菌均由江西农业大学森林保护学实验室提供。

1.1.2培养基纤维素刚果红培养基、PDA培养基、PDB培养基等配方参考张喜庆等[20]。

1.2 研究方法

1.2.1雷竹根部内生真菌的分离将采集的雷竹根部样品用自来水清洗干净以除去根表面泥沙等杂质，用无菌水清洗3遍，然后用过滤纸吸干表面水分，过滤纸使用前进行高压灭菌。根部内生真菌的分离具体参考王盈桐等[21]，内生真菌纯化后再转接到PDA斜面4 ℃保藏备用。

1.2.2雷竹功能内生真菌筛选重金属耐受性菌株筛选操作方法参考曾松荣等[22]；病原菌抑菌活性内生真菌筛选参考陈迪等[23]；纤维素降解内生真菌筛选参考景如贤等[24]。

铅耐受指数（TI）计算公式：

TI≥50%，则表示内生真菌对Pb2+具有耐受能力，反之则表示对Pb2+不具备耐受能力。

1.2.3功能性内生真菌鉴定采用形态学及 ITS 序列比对进行鉴定[25]，将测定的序列提交GenBank数据库进行相似性比较分析，用MEGA5.0软件进行系统发育分析，并建立系统进化树。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的分离

利用组织块分离法，从雷竹根部共分离得到35株内生真菌，表明雷竹根系内生真菌资源较为丰富，部分分离纯化的内生真菌见图1。

图1 部分分离纯化的内生真菌

2.2 内生真菌功能性筛选

2.2.1重金属耐受性菌株筛选由表1可知，从雷竹根部中共筛选出具有重金属耐受性的菌株有11株。其中菌株LZ022、菌株LZ033、菌株LZ020、菌株LZ034、菌株LZ035的TI值均高于100%；菌株LZ023、菌株LZ031、菌株LZ014、菌株LZ026、菌株LZ016、菌株LZ015的TI值均在60%～100%，表明以上11株菌株对重金属铅具有较强的耐受能力。

表1 具有耐受性的内生真菌在一定Pb2+浓度下的TI值

2.2.2病原菌抑制的平板筛选雷竹内生真菌对3种病原菌的抑制结果见图2。菌株LZ031和菌株LZ012对毛竹枯梢病原菌、猕猴桃果腐病原菌、油茶炭疽病原菌均有抑制作用；而菌株LZ022、菌株LZ004、菌株LZ005仅对油茶炭疽病原菌有抑制作用。

图2 部分内生真菌对3种病原菌的抑制效果

2.2.3具有纤维素降解功能的内生真菌筛选对雷竹内生真菌进行纤维素刚果红平板培养发现，共筛选出7株菌株具有明显的透明圈。菌株LZ011、菌株LZ033和菌株LZ028的D/d比值均高于3.0；菌株LZ008和菌株LZ003的D/d比值均为2.0～3.0；菌株LZ031和菌株LZ012的D/d比值均在1.0～2.0。表明菌株LZ011、菌株LZ033和菌株LZ028具有较好的纤维素降解能力(表2)。

表2 部分纤维素降解菌株D/d值

综上所述，菌株LZ031对油茶炭疽病原菌、毛竹枯梢病原菌、猕猴桃果腐病原菌均有抑制作用，对重金属具有耐受性，且具有较强纤维素降解能力。菌株LZ033对重金属耐受能力强，且具有较强纤维素降解能力。因此，菌株LZ031和菌株LZ033都是具有潜在应用价值的功能菌。

2.3 内生真菌鉴定

2.3.1形态鉴定由表3可知，菌株LZ031形态特征与腐皮镰刀菌（Fusarium solani）基本一致，初步鉴定菌株LZ031为腐皮镰刀菌。菌株LZ033形态特征则与芦竹节菱孢（Arthrinium arundinis）基本一致，故初步鉴定为芦竹节菱孢菌株LZ031和菌株LZ033的显微结构见图3。

图3 菌株LZ031（A）和LZ033（B）的显微结构

表3 菌株LZ031和菌株LZ033形态特征

2.3.2分子鉴定将菌株所测的ITS序列与GenBank及EzTaxon近缘种序列进行同源性比对，利用MEGA5.0采用Neighbor Joining法构建系统发育树。由图4可知，菌株LZ031与镰刀菌属具有较高的序列相似性，且与Fusarium solani（KJ019829）在同一分支聚集，亲缘关系最近。菌株LZ033与节菱孢属具有较高的序列相似性，且与Arthrinium arundinis的亲缘关系最近。

图4 基于ITS序列构建的菌株LZ031系统发育树

综合菌株形态特征和ITS序列分析，将菌株LZ031鉴定为腐皮镰刀菌（F. solani），菌株LZ033鉴定为芦竹节菱孢（A. arundinis）。

3 结论与讨论

本研究从雷竹根部分离筛选出11株对铅具有耐受能力的内生真菌，其中5株对铅表现出较强的耐受能力，TI>100%，表明植物内生真菌在抵抗重金属污染方面具有重要的作用，这与前人研究结果一致[26-28]。此外，本研究筛选出5株内生真菌对油茶炭疽病原菌有拮抗作用，2株对毛竹枯梢病原菌有拮抗作用，2株对猕猴桃果腐病原菌有拮抗作用，其中菌株LZ031对油茶炭疽病原菌、毛竹枯梢病原菌、猕猴桃果腐病原菌均有较为明显的拮抗作用，这与纪丽莲[29-30]在病原菌抑制研究上结果一致。本研究采用羧甲基纤维素钠平板法和刚果红染色法[20]筛选出7株在降解纤维素方面具有显著效果的内生真菌菌株，其中3株具有较强的降解纤维素的能力，这表明雷竹根部的内生真菌在降解纤维素方面具有较为丰富的资源。

植物中的内生真菌种类众多，资源丰富，是一类未被大量研究且前景广阔的微生物。本研究从重金属耐受，病原菌抑制，纤维素降解3个方面对从雷竹根部分离出来的内生真菌进行功能性初步筛选，研究结果表明，雷竹根部具有较为丰富的功能菌株资源。而对于菌株生物学特性、降解性能等方面的研究还不够深入和广泛，后期应结合定量实验做进一步的补充和完善。