枇杷炭疽病病原菌鉴定及防治药剂筛选

王文静，甘 震，石绪根，宋水林，郭德康，陈丽林，况卫刚

（江西农业大学 农学院，江西 南昌 330045）

【研究意义】枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）隶属于蔷薇科（Rosaceae）、枇杷属（Eriobotrya），其栽培历史已超过2 000年，别名又叫芦橘、芦枝、金丸、炎果、焦子。其易于栽培种植，适应性较强，经济效益高，果实不仅营养丰富、风味独特，而且具有润肺、抗炎、止咳平喘、健胃润脾等功效，因而深受国内外消费者喜爱，从而成为了世界性精美果品之一[1]。枇杷在30多个国家和地区均有分布和栽培[2-3]，其中我国枇杷的栽培面积和总产量均居于世界首位。枇杷在浙江、福建、江西等地广泛种植，其中安义枇杷是江西省特产，历史悠久。由于具有较高的经济价值，枇杷逐渐成为栽培区农村经济发展的支柱产业之一。但是，枇杷从种植、采收到果实的贮存、运输等整个过程中都会受到各种病害的危害。常见的有灰斑病、轮纹病、炭疽病、叶尖焦枯病、圆斑病等，这些病害会导致树势早衰、果实产量和品质下降，成为限制枇杷产业快速发展的主要因素[4]。【前人研究进展】国内外关于枇杷病害的研究很多，Perell等[5]从培养物及分生孢子形态特征、致病性测定等方面将阿根廷枇杷灰斑病致病菌鉴定为Pestalotiopsis guepinii。Chen等[6]从中国安徽省泾县枇杷灰斑病病样上分离到致病菌，通过形态学观察和分子生物学技术将其鉴定为P. theae。Xiao等[7]研究结果表明安徽省黄山市枇杷灰斑病的病原为Pestalotiopsis microspora。日本的相关学者认为P. eriobotryfolia、P. funerea、P. adusta、P. eugeniae、P. longiaristata均可引起枇杷灰斑病[8]。研究学者对福建[9]、贵州[10]等地枇杷病害研究表明，病原菌Ascochyta eriobotryae可导致枇杷轮纹病。而对于枇杷炭疽病的病原，研究结果表明Colletotrichum acutatum和C. siamense均可导致枇杷炭疽病的发生[11]。炭疽菌属种类多样，存在多个复合种，如C. gloeosporioides复合种、C. acutatum复合种和C. magnum复合种等。这些炭疽菌形态特征不稳定，很难通过形态学进行鉴定[12]。ITS作为用于真菌鉴定的DNA条形码，对很多真菌种类鉴定效果较好，但是很难将炭疽菌复合种区分开[13]。随着分子生物学发展，不同的分子标记如ACT，TUB2，GPDH和ApMat (APN2/MAT-IGS)等用于炭疽菌的鉴定中，使得鉴定结果更为准确[14]。张丹华等[15]研究表明，不同地域枇杷病害的病原菌可能不一致。鉴于炭疽菌种类多样，寄主范围广泛，我国枇杷种植分布又较广，因而有必要对枇杷上的炭疽病菌种类进一步研究。【本研究切入点】近年来，枇杷炭疽病发生越来越重，但是对于引起江西枇杷炭疽病的病原尚缺乏研究。【拟解决的关键问题】本研究拟对对江西省宜春市枇杷炭疽病病原进行鉴定，进一步采用菌丝生长速率法分别测定了6种不同药剂对枇杷炭疽病菌的室内毒力，以期为病害的综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

枇杷炭疽病病叶采自江西省宜春市上高县果园。

1.2 供试药剂

30%苯甲·嘧菌酯悬浮剂（陕西标正作物科学有限公司）；75%戊唑•嘧菌酯水分散性粒剂（上海绿泽生物科技有限责任公司）；50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂（苏州富美实植物保护剂有限公司）；75%肟菌•戊唑醇水分散性粒剂（拜尔股份公司）；400 g/L氟硅唑乳油（江门市大光明农化新会有限公司）；1%申嗦霉素悬浮剂（江苏好收成韦恩农化股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1病原菌分离培养采用组织分离法对病原菌进行分离，在超净工作台内将刀片灭菌后切取病叶病斑交界处组织块，每片叶片取1～2个。将病样组织用体积分数为70%酒精浸泡30 s、0.1%的升汞浸泡2min、无菌水冲洗3次，将消毒后的病样组织置于灭菌的滤纸上晾干，置于PDA培养基上，在24 ℃恒温培养箱中进行培养。每天观察，待病样组织中长出菌丝后及时纯化，保存4 ℃备用。

1.3.2病原菌鉴定将经过纯化处理的病原菌进一步培养，等菌丝长出后，拍照记录菌落正反面形态。同时制作临时玻片，在显微镜下察看其分生孢子形态特征，并测量其大小。

将纯化后的真菌在PDA培养基上培养7 d后，采用生工生物真菌DNA提取试剂盒（货号B518259）提取其基因组。选取炭疽菌ApMat引物CgDL_F6（5'-AGTGGAGGTGCGGGACGTT-3'）和CgMAT1_F2（5'-TGATGTATCCCGACTACCG-3'）[16]对真菌的ApMat区域进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL：基因组DNA 2 μL，CgDL_F6 1 μL，CgMAT1 F2 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。

PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物之后，将PCR产物送到生工生物工程（上海）有限公司进行序列测定。将测序获得的结果提交至NCBI数据库中进行BLAST比对，得到鉴定结果。

1.3.3室内毒力测定本研究选取生产上常用的防治炭疽病菌的药剂，苯甲·嘧菌酯、戊唑·嘧菌酯、咪鲜胺锰盐、肟菌·戊唑醇、氟硅唑、申嗦霉素，进行各药剂室内毒力测定。用菌丝生长速率法测定不同杀菌剂对枇杷炭疽病病原菌菌丝生长的影响。将药剂推荐的使用浓度作为初始浓度，用无菌水将各杀菌剂10倍梯度稀释，配置成6个不同溶度的母液。用移液器吸取2 mL的不同浓度的供试药剂母液，分别加入到18 mL灭菌的PDA培养基，充分混匀后倒入培养皿中，配制成不同浓度的含药培养基。用无菌打孔器在枇杷炭疽病菌菌落边缘处打孔取5 mm的菌饼，接种在含药PDA平板的中央，以未加入药剂的PDA培养基为对照，每个处理重复3次。接种后置于24 ℃恒温箱中倒置培养，待对照组菌饼长至整个培养皿的2/3时，用十字交叉法测量供试菌株在不同浓度药剂平板上的菌落直径，按照下列公式计算供试药剂在不同药剂浓度下的菌丝生长抑制率。

利用SPSS软件求出抑制率机率值（y）与浓度对数（x）之间的毒力回归方程、抑制中浓度EC50值及相关系数（r）。

2 结果与分析

2.1 枇杷炭疽病症状

炭疽病在枇杷整个生长期都可以发生，主要危害叶片和果实，在果实储藏运输期间也可发生。本研究通过田间对叶片症状进行了观察，叶片受害初期病斑呈褐色，圆形或近圆形，后期病斑边缘呈现暗褐色，中央变为灰白色，田间受害症状如图1。

图1 枇杷炭疽病叶片发病症状

2.2 病原菌鉴定

对分离到的真菌进行观察，发现其菌落呈现灰白色，随后颜色逐渐加深，在PDA培养基上于25 ℃、黑暗环境条件下培养7 d后，菌丝长满整个培养皿，后期菌落上出现桔红色的分生孢子团（图2）。显微镜观察到该菌分生孢子单胞、卵圆形、透明，两端钝圆，大小为（13.6～16.5）μm×（5.8～7.1）μm。通过查询相关文献，认为该真菌形态特征与果生炭疽菌一致[17]。

图2 枇杷炭疽病菌菌落特征和分生孢子形态

对所获得的菌株进行PCR扩增，结果如图3所示，所得的电泳条带明亮且单一，与Marker 2000比较，扩增获得的片段大小约在750～1 000 bp（图3）。利用CgDL_F6和CgMAT1_F2引物对PCR产物进行双向测序，经NCBI比对，结果显示其序列与果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）的相似性和一致性均为100%。

图3 供试菌株PCR扩增产物电泳结果

2.3 几种杀菌剂对枇杷炭疽病菌的室内毒力比较

由表1可见，6种杀菌剂对枇杷炭疽病菌均表现出一定的抑制效果，但对菌丝生长的抑制效果不同，毒力差异较大。从药剂的EC50来看1%申嗦霉素SC抑菌效果最强，其EC50为0.014 mg/L；其次是30%苯甲·嘧菌酯SC、50%咪鲜胺锰盐WP和400 g/L氟硅唑EC，也表现出较好的抑制效果，EC50分别为0.020，0.021，0.026 mg/L；而75%戊唑·嘧菌酯WDG和75%肟菌·戊唑醇WDG表现出的抑菌活性一般，其EC50分别为0.560 mg/L和0.405 mg/L。

表1 6种杀菌剂对枇杷炭疽病菌的毒力

3 讨论与结论

炭疽菌属（Colletotrichum）真菌可以危害200多种植物，是重要的植物病原真菌。该真菌在自然界分布普遍，国内外有关炭疽病菌危害的报道屡见不鲜。由炭疽菌属引起的枇杷炭疽病危害严重，制约枇杷产业链的健康发展。研究表明引起枇杷炭疽病的病原菌种类多样，Cao等[18]研究表明Colletotrichum acutatum能够引起枇杷采后果实炭疽病，李小霞等[19]基于ITS序列分析，认为引起贵州枇杷炭疽病的病原为胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），Wu等[20]基于多基因序列分析结果表明，成都枇杷果实炭疽病病原为C. nymphaeae。本研究通过对江西省宜春市上高县枇杷炭疽病进行调查取样，基于ApMat基因序列分析，结果表明病原菌为果生炭疽菌（C. fructicola）。

为了筛选合适的药剂用于田间枇杷炭疽病菌的防治，本研究利用生产上常用的6种杀菌剂对分离获得的枇杷炭疽病菌进行室内毒力测定。结果表明，6种杀菌剂对病原菌的生长均有一定程度的抑制效果。1%申嗦霉素抑菌效果最好，其次为30%苯甲·嘧菌酯、50%咪鲜胺锰盐、400 g/L氟硅唑。申嗪霉素是由荧光假单胞菌M18分泌的一种抗菌素，同时具有广谱抑制植物病原菌并促进植物生长作用的双重功能的杀菌剂，具有广谱、高效的特点，对多种病原真菌、细菌具有较好的抑制效果，尤其是在跟其它药剂配比时表现出良好的增效作用[21]。苯甲·嘧菌酯、咪鲜胺锰盐和氟硅唑是生产上用于防治炭疽病较好的药剂，具有很好的应用潜力。后续需要进一步对这几种药剂的田间效果进行试验，同时在田间生产使用过程中进行药剂轮换使用，以避免产生抗药性。