内蒙古马铃薯主栽品种对腐烂茎线虫病的室内抗性评价

王 东，张 妞，赵远征，孟焕文，梁东超，周洪友

（1. 内蒙古农业大学 园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2. 内蒙古自治区农牧业科学院 植物保护研究所，内蒙古 呼和浩特 010031；3. 内蒙古自治区马铃薯繁育中心，内蒙古 呼和浩特 010010）

我国是世界上最大的马铃薯生产国，目前，马铃薯的产量和种植面积均居世界首位。马铃薯是内蒙古的重要经济作物，种薯生产和商品薯加工业等马铃薯产业在地区经济中占有举足轻重的地位，在全国也处于领先地位[1]。近年来，我国马铃薯腐烂茎线虫病的危害日益严重，在内蒙古自治区、河北省、吉林省、辽宁省、河南省等地均有分布[2]。据统计，马铃薯腐烂茎线虫病可造成马铃薯减产20%～30%，严重时减产40%～50%，甚至绝收，严重威胁马铃薯相关产业的发展[2]。

马铃薯腐烂茎线虫病由腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）引起，该线虫是世界上重要的植物病原线虫，属于迁移性植物内寄生线虫，也是国际上重要的检疫性线虫[3⁃4]。已报道的该线虫寄主超过120 种[5]，主要寄主为马铃薯和甘薯，通过匍匐茎或块茎的皮孔和薯眼侵入薯块，引起薯苗的矮化、加粗和分支。腐烂茎线虫侵染马铃薯薯块初期形成侵染点，薯块表皮呈浅灰色，表皮易脱落，随着线虫在薯内聚集，侵染部位逐渐扩大，呈灰褐色，后期病变组织变干或海绵状，表现为干腐或湿腐，表皮皱缩、凹陷、龟裂，呈暗黑色，线虫在侵染块茎的病健交界处繁殖，且伴有细菌、真菌和螨类二次侵染，导致整薯腐烂变质[6⁃9]。

关于马铃薯腐烂茎线虫病的防治，首先应当加强植物检疫力度，严防腐烂茎线虫的传播和蔓延。有研究表明，合理轮作、覆盖地膜等农业措施对防治该病害具有较好作用[10⁃11]。在化学防治方面，2 000 μg/mL 丁硫克百威乳油、180 μg/mL 阿维菌素乳油和溴氰菊酯等化学药剂均对该线虫病害具有较好的防治效果[12⁃13]。生物防治具有致毒作用小、环境兼容性好等优点。苏云金芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌等芽孢杆菌属菌株对腐烂茎线虫具有较高毒力，芽孢杆菌菌株SMrs28的发酵液粗提物表现出较强的杀线虫活性，其主要化合物对腐烂茎线虫具有毒杀作用[14⁃16]。但由于腐烂茎线虫侵染所引起的马铃薯腐烂茎线虫病具有隐蔽性、突发性和流行性特点[17]，单独应用以上措施对该病害进行防治均具有一定的局限性。因此，对于马铃薯腐烂茎线虫病的有效防控应当坚持“预防为主、综合防治”的植保方针，而抗病品种的选育与应用也成为综合防控技术中不可或缺的方法之一。目前，波兰、德国、保加利亚等国家通过田间和盆栽试验已筛选出一些较为抗病的品种，例如Spunta、Hela、Achilles、Laura、Hansa 等[18⁃20]。我国在相关领域的研究较少，马铃薯主栽品种对该病害的抗性水平尚不明确，仅徐鹏刚[21]研究发现克星1 号和陇薯6 号2 个抗病品种，以及陇薯7 号、黑美人、早大白等7 个中抗品种。鉴于此，通过室内接种法对内蒙古23个马铃薯主栽品种进行抗性鉴定，综合利用块茎发病程度和线虫繁殖量2 种评价方法，明确内蒙古主栽马铃薯品种对马铃薯腐烂茎线虫病的抗性水平，以期筛选出对腐烂茎线虫具有较高抗性的马铃薯品种，为该病害的有效防治奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试线虫 马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）分离自马铃薯病薯，并转接于健康薯块中进行扩繁，室温条件下保存于内蒙古农业大学园艺与植物保护学院植物病理研究室。

1.1.2 供试品种 大西洋、希森6 号、费乌瑞它、克新1 号、黄金薯、丽薯6 号、青薯9 号、陇薯3 号、思凡特、冀张薯5 号、冀张薯22 号、冀张薯12 号、中薯2号、中薯3 号、中薯13 号、中薯15 号、中薯26 号、延薯8号、晋薯18号、早大白、荷兰806、N3和MX-8共23个马铃薯主栽品种，均由内蒙古自治区马铃薯繁育中心提供。

1.1.3 供试试剂 线虫ITS 区通用引物，TW81：5'-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3'，AB28：5'-TTA⁃AGTTCAGCGGGT-3'；腐烂茎线虫B型特异性引物，DdL1：5'-TTGTGTTTGCTGGTGCGCTTGT-3'，DdL2：5'-GAGTGAGAGCGATGTCAACATTG-3'，均 由 生工生物工程（上海）股份有限公司合成；DNA 提取试剂盒购自大连宝生物（TaKaRa）公司，EasyTaqPCR SuperMix 购自北京全式金生物技术有限公司，2×TaqPCR Mix 购自生工生物工程（大连）股份有限公司，TAE 缓冲液购自生工生物工程（上海）有限公司，核酸染料购自百泰克生物科技有限公司，琼脂糖购自上海致化化学科技有限公司。

1.1.4 主要仪器 NSZ-606 体视显微镜，宁波永新光学股份有限公司生产；5424 离心机，德国Eppendorf 公司生产；KG-SX-500 蒸汽灭菌锅，日本Tomy Digital Biology 公司生产；HWS-26 电热恒温水浴锅，上海-恒科学仪器有限公司生产；S1000 PCR扩增仪、Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统，美国BIORAD 公司生产；JY-ECP3000 电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司生产；Eco-Q30纯水系统，上海和泰仪器有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 线虫悬浮液的制备 采用改良贝曼漏斗法，从病薯中分离马铃薯腐烂茎线虫[22⁃23]。利用吸管将分离获得的线虫转移至10 mL 离心管中，加入相对密度约为1.18 的蔗糖溶液，3 500 r/min 离心2 min；取上层线虫悬浮液，转移至无菌水中，4 000 r/min离心5 min；弃上清液，用0.5%的次氯酸钠消毒1 min后，4 000 r/min 离心5 min；弃上清液，加入0.5%硫酸链霉素和0.5%青霉素的混合液消毒6 min，离心后吸出消毒液，用无菌水冲洗3次，获得线虫悬浮液（约1 000条/mL），4 ℃保存备用[24]。

1.2.2 腐烂茎线虫DNA 的提取 参照TaKaRa 基因组DNA 提取试剂盒的方法进行腐烂茎线虫DNA 的提取。

（1）挑取若干条线虫放入1.5 mL 离心管中，无菌水冲洗3次。

（2）在无菌载玻片中央滴入1 滴ddH2O，挑取1条线虫放入ddH2O 中，用手术刀将线虫切成小段，用移液枪吸入到1.5 mL离心管。

（3）加入180 μL Buffer GL、20 μL Proteinase K和10 μL RNasse A（10 mg/mL），于56 ℃水浴至组织完全裂解，裂解后12 000 r/min离心2 min。

（4）向 裂 解 液 中 加 入200 μL Buffer GB 和200 μL 100%乙醇，充分吸打均匀，将Spin column安置于Collection tube 上，溶液移至Spin column 中，12 000 r/min离心2 min，弃滤液。

（5）将500 μL 的Buffer WA 加入至Spin column中，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。

（6）将700 μL 的Buffer WA 加入至Spin column中，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。

（7）重复步骤（6）。

（8）将Spin column 安置于Collection tube 上，12 000 r/min离心2 min。

（9）将Spin column 安置于新的1.5 mL 离心管上，在Spin column 膜 的 中 央 加 入50～200 μL 的Elution buffer，室 温 静 置5 min，12 000 r/min 离 心2 min洗脱DNA。

1.2.3 马铃薯腐烂茎线虫的分子鉴定 参照于海英等[25]的报道，选用通用引物TW81 和AB28 鉴定线虫的rDNA-ITS ，同时参考宛菲等[26]报道的腐烂茎线虫B型特异性引物DdL1和DdL2 进行验证。PCR扩 增 体 系25 μL：模 板DNA 3 μL，ddH2O 8 μL，2×TaqPCR Mix 12 μL，上、下游引物各1 μL。

rDNA-ITS 鉴定反应条件：94 ℃预变性4 min，1个循环；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，1个循环；-20 ℃保存。

腐烂茎线虫B 型特异性引物鉴定反应条件：94 ℃预变性4 min，1个循环；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延 伸1 min，35 个 循 环；72 ℃延 伸10 min，1个循环；-20 ℃保存。

将扩增产物在1%琼脂糖凝胶中电泳检测后，送华大基因科技股份有限公司进行测序，获得序列经NCBI 数据库在线BLAST 比对分析，并利用MEGA 7.0软件中的邻接法构建系统发育树，分析其系统发育特征。

1.2.4 马铃薯腐烂茎线虫室内接种 参照宫卫波等[27]的方法进行。每个马铃薯品种选择3 个薯形、单薯质量基本一致，表皮光滑无畸形的健康块茎。将马铃薯块茎表面用清水冲洗干净、晾干，用75%乙醇进行表面消毒。将解剖刀用乙醇灯火焰消毒后，在块茎上切取1 个深度为3 cm 达薯块中心的三角形薯块组织；将制备好的线虫悬浮液用移液枪接入三角形穴内，每个块茎接500 μL 线虫悬浮液（约含500条线虫）；并将切下的三角形薯块组织塞回原处，用石蜡封住伤口，贴上标签。每个马铃薯品种重复3次，并以相同方法接入等量无菌水的马铃薯块茎作为对照，25 ℃下暗培养90 d。

1.2.5 马铃薯块茎发病程度抗性评价方法 参考张香蓉[28]、徐鹏刚[21]的方法，将马铃薯块茎接种腐烂茎线虫90 d 后，在接种点部位横切薯块，根据发病面积大小将发病程度分为五级，0 级：无病；1 级：发病面积占薯块横切面积的25%以下；2级：发病面积占薯块横切面积的25%～50%；3 级：发病面积占薯块横切面积的50%～75%；4 级：发病面积占薯块横切面积的75%以上。

发病等级计算方法：在供试的不同马铃薯品种中，每个等级薯块发病数量在2 个及以上确定为同一个发病等级。

发病程度：抗病（R），发病等级为1 级以下；中抗（MR），发病等级为2～3 级；感病（S），发病等级为4级。

1.2.6 腐烂茎线虫繁殖量抗性评价方法 参考HASHIMOTO 等[29]的方法，采用1—9 的评分等级进行评价。马铃薯块茎接种腐烂茎线虫90 d 后，将每个品种的块茎称质量后切碎混匀，称取30 g 分离马铃薯薯块中的线虫，利用改良贝曼漏斗法分离。每个品种重复3 次，每个品种最初线虫接种数量为500条，以标准易感品种大西洋为对照品种，在体视显微镜下计数，计算公式：

线虫繁殖数量=（30 g 马铃薯中的线虫总数量/30）×马铃薯的总质量-500；

相对易感性=测试品种的线虫繁殖数量/标准易感对照品种线虫繁殖数量×100%。

1—9分的评分等级对应的相对易感性值：1（＞100.0%）、2（50.1%～100.0%）、3（25.1%～50.0%）、4（15.1%～25.0%）、5（10.1%～15.0%）、6（5.1%～10.0%）、7（3.1%～5.0%）、8（1.1%～3.0%）、9（≤1.0%）。

抗性等级：评分8～9 分为抗病（R）、3～7 分为中抗（MR）、1～2分为感病（S）。

1.3 数据处理

采用SPSS 24.0 统计软件进行数据分析，采用Duncan’s 新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 马铃薯腐烂茎线虫的分子鉴定结果

以AB28 和TW81 为通用引物，利用rDNA-ITS对CFXC（马铃薯腐烂茎线虫）群体进行鉴定，电泳图谱显示，PCR 扩增得到的片段大小为922 bp（图1），测序及系统发育分析表明，该线虫与马铃薯腐烂茎线虫（登录号：HQ235698.1）的相似性达到99.71%（图2）。利用特异性引物DdL1/ DdL2 扩增得到485 bp 的特异性DNA 片段（图3），确定该线虫群体为侵染马铃薯的腐烂茎线虫B型。

2.2 不同品种马铃薯块茎腐烂茎线虫病发病症状

接种腐烂茎线虫90 d 后，23 个马铃薯品种均表现出发病症状，但发病程度存在差异（图4—7）。费乌瑞它、大西洋、黄金薯、丽薯6 号、思凡特、冀张薯5号、中薯3号、中薯13号和中薯15号共9个品种发病最重，薯块表皮皱缩、龟裂和凹陷，颜色呈暗黑色，内部组织变成海绵状，表现为干腐或湿腐，且部分马铃薯腐烂变质（图4）；冀张薯12 号和MX-8 薯块表皮皱缩、龟裂和凹陷，以及横切后内部组织干腐和湿腐（图5）；冀张薯22 号、中薯26 号、荷兰806和N3共4个品种发病较轻，薯块表皮皱缩，有龟裂，横切后内部组织干腐、湿腐，且薯块腐烂变质（图6）；希森6 号、克新1 号、青薯9 号、陇薯3 号、中薯2号、延薯8号、晋薯18号和早大白共8个品种发病最轻，马铃薯表皮皱缩、有病斑，但面积小，薯块表皮下有白色斑点，薯肉颜色接近于健康薯肉且腐烂程度较轻（图7）。

2.3 不同品种马铃薯腐烂茎线虫病发病等级

接种腐烂茎线虫90 d 后，费乌瑞它、大西洋、黄金薯、丽薯6号、思凡特、冀张薯5号、中薯3号、中薯13 号和中薯15 号发病最重，薯块发病面积达75%以上，根据发病面积划定其发病等级为4级；冀张薯12号和MX-8薯块发病面积达50%～75%，发病等级为3 级；冀张薯22 号、中薯26 号、荷兰806 和N3 发病较轻，薯块发病面积达25%～50%，发病等级为2级；希森6号、克新1号、青薯9号、陇薯3号、中薯2号、延薯8 号、晋薯18 号和早大白发病最轻，薯块发病面积在25%以下，发病等级为1级（表1）。

表1 不同品种马铃薯腐烂茎线虫病发病等级Tab.1 Incidence grade of rot stem nematode disease in different potato varieties

2.4 不同品种马铃薯腐烂茎线虫繁殖量

接种腐烂茎线虫90 d 后，不同马铃薯品种腐烂茎线虫的繁殖数量差异显著（表2）。费乌瑞它块茎中的腐烂茎线虫繁殖量最大，达50 147.91 条；其次为中薯15 号和中薯13 号，数量分别为46 417.83、36 397.97 条；其余品种腐烂茎线虫数量在384.69～27 761.88 条；陇薯3 号、早大白、希森6 号、克新1 号和青薯9 号的腐烂茎线虫数量较少，分别为384.69、475.99、515.20、731.30、784.95 条，且品种间差异不显著。

2.5 不同品种马铃薯腐烂茎线虫病的抗性评价结果

根据马铃薯块茎发病程度进行评价，筛选出抗病品种8 个，分别为希森6 号、克新1 号、青薯9 号、陇薯3 号、中薯2 号、延薯8 号、晋薯18 号和早大白；中抗品种6个，分别为冀张薯22号、中薯26号、荷兰806、N3、冀张薯12 号和MX-8；感病品种9 个，分别为费乌瑞它、大西洋、黄金薯、丽薯6 号、思凡特、冀张薯5号、中薯3号、中薯13号和中薯15号（表3）。

表3 基于不同品种马铃薯腐烂茎线虫病发病程度的抗性评价Tab.3 Evaluation of resistance according to the incidence of rot stem nematode disease in different potato varieties

续表3 基于不同品种马铃薯腐烂茎线虫病发病程度的抗性评价Tab.3（Continued） Evaluation of resistance according to the incidence of rot stem nematode diseuse in different potato varieties

基于不同马铃薯品种对腐烂茎线虫具有不同程度的相对易感性，从而表现出不同程度的抗性水平，共筛选出抗病品种3 个，分别为陇薯3 号、早大白和希森6 号；中抗品种12 个，分别为思凡特、冀张薯12 号、冀张薯22 号、荷兰806、中薯2 号、中薯26号、延薯8 号、MX-8、晋薯18 号、N3、克新1 号和青薯9 号；感病品种8 个，分别为大西洋、黄金薯、费乌瑞它、丽薯6 号、冀张薯5 号、中薯3 号、中薯13 号和中薯15号（表4）。

表4 基于不同品种马铃薯腐烂茎线虫繁殖量的抗性评价Tab.4 Evaluation of resistance according to the reproductive capacity of D.destructor Bin different potato varieties

综合分析，陇薯3 号、早大白和希森6 号在2 种评价体系中均表现为抗病，说明其对马铃薯腐烂茎线虫病的抗性最强；大西洋、黄金薯、费乌瑞它、丽薯6 号、冀张薯5 号、中薯3 号、中薯13 号和中薯15号在2种评价体系中均表现为感病，抗性最差。

3 结论与讨论

本研究分别依据马铃薯块茎发病程度和腐烂茎线虫繁殖量对内蒙古23 个马铃薯主栽品种进行了抗性评价，综合2 种方法后明确了陇薯3 号、早大白和希森6号对马铃薯腐烂茎线虫病具有较高的抗性。目前，国内外已筛选获得的对马铃薯腐烂茎线虫病具有较高抗性的品种较少。依据马铃薯块茎发病程度，徐鹏刚[21]筛选出克星1号（克新1号）和陇薯6 号2 个抗病品种，本研究筛选出希森6 号、克新1 号、青薯9 号、陇薯3 号、中薯2 号、延薯8 号、晋薯18 号和早大白共8 个抗病品种。参考HASHIMOTO等[29]评分等级，MWAURA 等[19]筛选出Laura、Hansa、Festien 共3 个抗病品种，本研究利用该方法筛选出陇薯3号、早大白和希森6号共3个抗病品种。

依据马铃薯块茎发病程度对马铃薯腐烂茎线虫病进行分级，从薯块的内部和外部形态两方面对腐烂茎线虫病进行评价，具有直观、准确、可靠、周期短、简便高效、量大且不易受时间和环境等因素的限制等优点，但不能够反映出不同品种间线虫繁殖量差异性，无法评价马铃薯表皮组织对该线虫的抗侵入性。本研究利用此方法筛选出希森6 号等8个抗病品种，而林松茂[30]、谢逸萍等[31]和王宏宝等[32]利用该方法评价甘薯对腐烂茎线虫病的抗性并对马铃薯和甘薯的块茎危害症状进行比较。基于不同马铃薯品种的腐烂茎线虫繁殖量对马铃薯腐烂茎线虫病进行抗性评价，将马铃薯品种分为更多的抗性类别进行量化分析，具有精确、可靠、科学等优点，但忽略了该病害对马铃薯造成的内外部损伤这一直观、可靠的评价指标。本研究利用此方法筛选出陇薯3 号等3 个抗病品种，MWAURA 等[19]利用此方法评价了马铃薯品种对马铃薯腐烂茎线虫和茎线虫的抗性。本研究首次将2 种评价方法相结合，筛选出陇薯3 号、早大白和希森6 号3 个抗病品种，解决单一使用马铃薯块茎发病程度对马铃薯腐烂茎线虫病进行分级评价无法具体量化该线虫侵染马铃薯时线虫繁殖数量的问题，同时克服单一利用不同马铃薯品种的腐烂茎线虫繁殖量对马铃薯腐烂茎线虫病进行抗性评价时忽视该病害对马铃薯造成的内外部损伤的评价指标的缺点，将2 种方法有效地结合，使评价结果更为可靠、准确、科学，综合2 种方法的评价结果来看，可将其联合起来作为一种评价马铃薯腐烂茎线虫病抗性科学、有效、快速的室内鉴定方法。

目前，利用甘薯等抗性品种防治腐烂茎线虫病取得了一定进展，如李秀英等[33]利用田间自然诱发鉴定法筛选出AB94078-1、徐1-4、徐3-2、徐58-1、鲁78066、AIS35-2、CNl232-9等抗病品种；孙璐等[34]通过田间试验筛选出徐紫、冀薯6-8、红心王和52-8等甘薯品种；段爱菊等[35]采取田间自然诱发鉴定和室内贮藏鉴定相结合的方法，选出抗病品种华北52-45、烟252、徐州781 和176；张勇跃等[36]通过田间试验发现漯薯11 和漯薯10 号对甘薯腐烂茎线虫病抗性较高，并推荐在北方薯区大面积推广应用；王富胜等[37]采用系统选择法选育出高产优质抗病当归新品种岷归5号。但关于马铃薯品种对腐烂茎线虫抗性鉴定及品种筛选工作研究较少，在抗性品种鉴定中多数马铃薯表现为感病品种[19，21]，与本研究结果较一致，表明现有马铃薯品种普遍对该病害抗性较差，应扩大品种抗性评价和筛选范围，以防止该病害持续蔓延。

马铃薯腐烂茎线虫病的防治以化学防治为主，生物防治、物理防治等措施为辅。化学方法见效快、效果显著、使用方便、不受地区和季节限制等，适于大面积防治，是有害生物综合治理中不可缺少的一环，有其他防治措施无法替代的优点。但也存在一些缺点，主要表现为一些剧毒农药易引起人畜中毒、农药残留污染环境、长期使用某些农药会引起有害生物产生抗药性以及杀伤有益生物。生物防治具有对非靶标生物安全、致毒作用小、环境兼容性好、不产生抗药性等优点，已成为防控腐烂茎线虫病害的重要手段，但其杀虫效果较慢，在高虫口密度下使用不能完全达到迅速压低虫口的目的，且筛选具有高效杀线效果的微生物资源耗时长、工作量大且人工繁殖培养有益微生物的技术难度较高。物理防治主要利用简单的器械和物理来防治病虫害的发生，具有节约成本、易操作、环保无污染的特点，但是该方法具有费时费工、效率低、难以彻底防治病虫害等缺点。而选育和利用抗病品种是防治植物病害最经济有效的途径，利用抗病品种可有效遏制多种经济作物重要病害的流行，同时对于许多难以运用化学防治和农业措施的病害如土传病害、病毒病害和林木病害，选育和利用抗病品种更是一种行之有效的防治措施，不仅防病效能高、节省成本，而且还可以代替或减少化学药剂和杀菌剂的使用，避免因使用农药而造成的残毒和环境污染问题。因此，本研究通过室内人工接种初步筛选出陇薯3 号、早大白和希森6 号3 个马铃薯抗病品种，对马铃薯腐烂茎线虫病抗性鉴定工作进行了补充。但由于室内人工接种与田间自然诱发存在一定差异，为确保研究的准确性和严谨性，在此后的研究中将会继续进行不同品种的田间抗性鉴定试验，以期筛选出高效、稳定的抗病品种，为该病害防控提供依据。