γ-氨基丁酸(GABA)对桑树耐盐能力的影响

张利琴 殷红燕 张 波 杨 健 李 燕

(1.泰安市林业保护发展中心，山东泰安 271000；2.济南协和双语实验学校，山东济南 250107)

桑树是家蚕的饲料树种，也是沙漠化治理、水土保持、盐碱地治理的重要生态树种，培育桑树抗盐品种，不仅有利于盐碱地的治理，而且对于桑树生态和经济价值的实现也具有重要意义。γ-氨基丁酸(GABA)是一种四碳非蛋白氨基酸，是植物抵抗逆境胁迫的主要代谢产物，在逆境胁迫下在植物体内大量积累，提高植物对逆境胁迫的适应能力[1]。在植物体内，GABA能调节细胞内pH、清除自由基、参与植物体内信号传导、调节逆境胁迫响应等[2]。GABA是除脯氨酸外，植物细胞内含量随环境盐浓度改变变化最大的氨基酸，也是从盐胁迫开始含量就显著增加的游离氨基酸[3]。有研究表明，施加外源GABA能够缓解盐胁迫对种子萌发过程中胚根的伸长和胚芽生长的抑制作用[4]，能提高植物体内谷氨酸脱羧酶(GAD)活性及氨基酸含量，减轻盐胁迫下叶片受活性氧(ROS)累积所导致的氧化损伤程度，增强植物对盐胁迫的抗性[5-6]。为探究γ-氨基丁酸(GABA)对桑树耐盐能力的影响，对NaCl胁迫处理下的桑树幼苗施用外源GABA，以期为桑树抗盐育种提供新种质。

1 实验方法

1.1 盐胁迫下桑树幼苗生长实验

前期准备：桂桑优62号桑树种子，要求籽粒大小一致、完整饱满。待种子萌发后，选取长势一致的桑树幼苗移栽到装有等量蛭石的花盆中，每盆1株，共培育12盆，放入长日照(D/N 16 h/8 h)人工气候培养箱中培养。

幼苗胁迫处理：幼苗生长两个月后，选取长势一致的幼苗进行控水，分别向托盘中浇灌等量清水、2 g·L-1、4 g·L-1、6 g·L-1、8 g·L-1及10 g·L-1的NaCl溶液，每天观察幼苗生长情况并记录，待幼苗出现明显胁迫表型时，拍照记录植株生长情况并测量植株株高、地上地下部分生物量各项指标，测量方法如下：

株高：测量植株根基部至主茎顶部(主茎生长点)之间的距离。

植株鲜重与干重：将植株分为地上部分与地下部分，用去离子水将植物材料冲洗干净，吸干植株表面水分，测量鲜重。再将植物材料放在105 ℃烘箱中烘干至恒重，测量干重。

1.2 盐胁迫下外源GABA处理试验

选取苗龄2个月长势一致的桂桑优62号桑树幼苗，设置四个处理组，每组3个重复，控水完全后进行以下处理：浇灌清水与叶片喷施清水；浇灌清水与叶片喷施50 mmol·L-1GABA；浇灌10 g·L-1NaCl与叶片喷施清水；浇灌10 g·L-1NaCl 与叶片喷施50 mmol·L-1GABA。

1.3 超氧阴离子自由基(O2-·)的测定

1)植物材料的准备：挑选成熟饱满，大小均匀的桂桑优62号种子，平铺于GM(100 mL去离子水中加入1 g蔗糖、1.3 g琼脂及0.237 g MS)培养板上，用封口膜密封完全，放入长日照人工气候培养箱中生长，待子叶完全展开，对幼苗进行NaCl处理；

2)将幼苗根部从培养基中分离，分别向培养皿中加入清水和10 g·L-1NaCl溶液，将幼苗根部浸没，根据已有的研究[7]，设置两个处理组，分别用1 mmol·L-1和10 mmol·L-1GABA正反面喷施NaCl处理的幼苗叶片，放入人工气候培养箱中处理0 h、6 h及12 h。清水处理作为空白对照，每个处理3个生物学重复，处理完成后用液氮将材料速冻并放入﹣80 ℃保存。处理方法如表1所示：

表1 桑树幼苗处理方法

3)配制NBT染色液：A液：Na2HPO4，B液：NaH2PO4，先将A液置于烧杯中，用B液调pH 7.6，配制成pH 7.6的10 mmol·L-1磷酸钠缓冲液，每100 mL磷酸钠缓冲液中加入50 mg NBT，配制完成后避光保存；

4)染色：将植物材料置于25 mL离心管中，加入20 mL染色液，室温下黑暗染色12 h，染色完成后，倒掉染色液，加入20 mL 95%乙醇，在100 ℃沸水浴中至组织完全脱色，拍照观察。

1.4 过氧化氢(H2O2)的测定

植物材料的处理方法同2.3一致。称取一定量的3,3-二氨基联苯胺(DAB)溶于pH 3.8的无菌ddH2O中，配制成1 mg·mL-1的DAB染色液(现用现配)，将NaCl处理的桑苗放入50 mL离心管中，加入30 mL DAB染色液，室温黑暗环境下染色12～16 h，染色完成后，倒掉染色液，加入30 mL 95%乙醇，在100 ℃沸水浴中至组织完全脱色，拍照观察。

2 结果与分析

2.1 外源GABA对桑树幼苗耐盐性的影响

为探讨外源GABA是否影响桑树幼苗的耐盐性，本研究对盐分胁迫下的桑树幼苗施用外源GABA，发现在正常生长条件下，与喷施清水处理(对照)相比，喷施50 mmol·L-1外源GABA对桑树幼苗的生长没有显著影响。但在10‰NaCl胁迫条件下，没有喷施50 mmol·L-1外源GABA的桑树幼苗植株矮小、叶片萎蔫，盐害症状明显，而施加50 mmol·L-1外源GABA的桑树幼苗盐害症状明显减轻。因此，在盐分胁迫条件下，外源GABA能明显缓解盐胁迫对幼苗生长的危害(图3-1)。

图2-1 外源GABA对NaCl胁迫下桂桑优62号幼苗生长的影响

2.2 外源GABA对NaCl胁迫下桑树幼苗中O2-·和H2O2含量的影响

采用NBT显色法测定了NaCl胁迫下桑树幼苗根系中O2-·含量(图2-2)，图中蓝色沉淀代表O2-·积累量，蓝色越深代表O2-·积累量越多。由图可知，在对照组幼苗的根中几乎检测到不到蓝色沉淀，而在NaCl处理组植株的根系中O2-·积累量随NaCl处理时间的增加而增多，并且NaCl浓度越高，根中O2-·积累量越大。但是，施用外源GABA可以明显减少胁迫处理条件下植株根中O2-·的积累量，并且施用的GABA浓度越大，根系中O2-·积累量越少。因此，施用外源GABA可以减少盐分胁迫下植物根中O2-·的积累。

图2-2 NBT溶液染色法检测桑苗根系中O2-·含量

同时，我们采用DAB显色法测定了桑树幼苗叶片中H2O2的积累量(图2-3)，图中棕色沉淀代表叶片中H2O2的积累量，棕色越深代表H2O2积累量越多。由图可知，在正常生长条件下桑树幼苗叶片经DAB染色，几乎检测不到棕色沉淀，表明H2O2的积累量极低。但NaCl胁迫处理6 h后叶片呈现明显的棕褐色，表明叶片中已有大量H2O2积累，胁迫处理12 h后，叶片棕褐色更加明显，表明叶片中H2O2积累显著增加。由图可以看出在盐分胁迫下对桑树幼苗施加外源GABA可以显著降低叶片中H2O2积累，并且施加的外源GABA浓度越大，叶片中H2O2积累量越少。因此，施用外源GABA可以减少盐分胁迫下桑树叶片中H2O2的积累。

图2-3 DAB溶液染色法检测桑苗叶片中H2O2含量

3 结论与讨论

已有研究表明，施加外源GABA可调控NaCl胁迫下植物体内的活性氧代谢，降低O2-·的产生速率，缓解ROS过量积累对细胞造成的氧化胁迫，维持细胞内环境稳定，保护叶绿体膜结构的完整性，维持植物正常生长发育[8]。我们的研究结果也表明外源GABA缓解了NaCl胁迫对桂桑优62号幼苗的危害，减少了植物体内O2-·和H2O2的积累量。但也有研究表明GABA含量与植物的耐盐性并不直接相关。Bao等[9]发现，盐胁迫处理会破坏番茄植株体内正常的GABA代谢，影响下游产物琥珀酸半醛(SSA)的代谢平衡，从而减少琥珀酸对TCA循环的补充。敲除番茄的SlGADs基因降低了番茄细胞内GABA浓度，而敲除SlGABA-Ts基因，则会增加细胞内的GABA浓度，但两者都降低了番茄幼苗的耐盐性。对盐胁迫下的拟南芥研究也发现，GABA分解过程的破坏也会导致植物耐盐性下降，表明GABA分解代谢是影响拟南芥耐盐性的关键[10]。因此，GABA含量与耐盐性并不直接相关，GABA分流支路可能才是影响植物抗逆性的关键[11-12]，此研究结果，在拟南芥和桑树毛状根中过表达GABA-T基因，降低了转基因植株对盐胁迫的抗性，但喷施外源GABA则可以缓解盐分胁迫的危害。这表明，尽管在转基因植株中GABA分解代谢过程得到加强，但是由于盐分胁迫下转基因植物体内的GABA合成速度与野生型植株相比并未提高，因此，并不能为TCA循环提供更多的物质补充，也不能增强转基因植物的耐盐性。但是，在拟南芥和桑树毛状根中过表达GAD则可以促进转基因植物体内GABA的合成，进而会促进GABA分解代谢过程，为TCA循环提供更多的物质补充，提高转基因植物的耐盐性。

有研究表明，GABA除了作为氮代谢的中间产物，在维持碳氮平衡中发挥重要作用外，GABA还具有较强的亲水能力及渗透调节能力，在逆境胁迫下具有与脯氨酸相似的功能，起到渗透调节作用[13]。盐分胁迫下，GABA能降低细胞质水势，减少细胞失水，缓解细胞因失水过多而产生的伤害[14]。我们的试验结果也表明施用外源GABA可以缓解NaCl胁迫对桑树和拟南芥的危害，这些外源的GABA可能会促进GABA分解代谢过程，为TCA循环提供更多的物质补充，也可能提高了植物细胞的渗透压，增强的植物细胞的吸水能力和持水能力，提高植物的耐盐性。在拟南芥和桑树毛状根中过表达GAD基因可能会促进转基因植物体内GABA的合成，为TCA循环提供更多的物质补充，也可能是提高了细胞内GABA的含量，增加了植物细胞的渗透压，从而提高植物的耐盐性，但具体的作用机制目前还不清楚。另外，还有研究认为，GABA还可能参与细胞间信号转导，在植物响应逆境胁迫方面具有重要作用[15]。因此，GABA对植物耐盐性的影响可能具有多种调控机制。通过对Mul-GAD基因启动子的活性实验发现，其除了具有NaCl胁迫诱导活性外，其还具有光照、ABA、SA和MEJA等多种诱导活性。这一方面表明Mul-GAD基因的表达受多种因素调控，也说明GABA可能参与植物体内多种调控途径。通过对Mul-GABA-T和Mul-GAD基因的组织表达分析发现，尽管两个基因都不具有组织表达特异性，但两个基因在不同组织中的表达模式并不相同。因此，两个基因可能具有不同的调控机制。综上所述，不仅GABA的代谢具有复杂的调控机制，其对于植物耐盐性的影响也具有复杂的调控机制。深入研究GABA的耐盐调控机制及其代谢途径相关基因在植物盐分胁迫响应过程中的作用，有助于发掘新的耐盐基因，全面解析植物的耐盐机制。