藏猪流行性腹泻病毒感染诊断

徐林，张朝辉，汤承，张斌

（1.四川省甘孜州动物疫病预防控制中心，四川 康定 626000；2.西南民族大学畜牧兽医学院，四川 成都 610041）

猪流行性腹泻病毒（PEDV）可引发猪只严重腹泻。PEDV基因组编码的刺突Spike（S）蛋白在感染宿主的过程中具有重要作用，分析S 基因可了解PEDV毒株分子特征。藏猪主要生活在青藏高原，腹泻是严重危害藏猪仔猪的常见疾病。

1 实验材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 某规模化藏猪场病猪的新鲜粪便样本。

1.1.2 主要试剂和仪器 Trizol 试剂盒（RNAiso Plus），DEPC，无水乙醇，异丙醇，QuickTaq HS DyeMix，Marker II，PrimerScriptTMRT 试剂盒，LB培养基，高速离心机等。

1.1.3 引物 检测引物序列如表1。

表1 检测引物序列信息表

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 粪便样本经处理后提取总RNA。利用PrimeScriptTMRT 试剂盒将RNA 反转录成cDNA。

1.2.2 RT-PCR检测腹泻病原 按照各个病毒检测引物相应的反应体系进行PCR 扩增反应，退火温度均为51 ℃。反应体系为：Quick Taq HS DyeMix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 3 μL。反应程序为：94 ℃ 2 min，94 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃30 s，循环36次，72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.2.3 PCR 产物的克隆、转化及测序 对检测呈阳性的PCR 产物进行纯化。按照PCR 纯化试剂盒说明书进行操作，以纯化目的条带。按照pMD19-T 载体说明书进行操作，进行连接。将上述的连接产物按照感受态细胞E.coli DH5α操作说明书进行转化。阳性克隆菌液外送测序。

1.2.4 PEDV S基因全基因扩增 挑选阳性样本进行完整的S 基因的扩增。PCR 反应体系为：Quick Taq HS DyeMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应程序为：94 ℃2 min，94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，循环35次，72 ℃延伸8 min，16 ℃保存。

1.2.5 系列相似性及进化树分析 将测序结果进行拼接比对，使用Megalign 6.0 软件和MEGA 7软件等进行序列分析。包括序列的同源性分析以及遗传进化分析。

2 结果

2.1 发病情况、临床诊断 发病猪场存栏约200头藏猪，猪群未进行腹泻病毒疫苗免疫接种。该场仔猪在饲养过程中出现腹泻等症状，并在短时间内出现较大范围的传播，部分圈舍猪发病率达80%，死亡率约10%。

发病仔猪采食量严重下降，精神差，严重者脱水、死亡。猪怕冷扎堆，瘦弱无力，多处黏膜发绀。个别病猪体温上升，排黄绿色水样恶臭粪便。剖检发现患猪主要病理变化出现于消化器官，其胃黏膜变红，肠黏膜脱落，肠壁充盈甚至透明，肠内充满水样物。初步诊断为病毒性感染。

2.2 腹泻病原RT-PCR 检测结果 采集3 份病猪新鲜粪便送实验室检测。采用RT-PCR 方法分别检测TGEV，PEDV，PDCoV 和PoRV，检测引物序列如表1。检测结果显示TGEV，PoRV 和PDCoV 均呈阴性，3 份样本PEDV 检测结果均呈阳性。PEDV 检测结果如图1。结果表明PEDV是导致藏猪场猪腹泻的主要原因。

图1 样本PEDV检测电泳图

2.3 序列分析 为了解PEDV 流行毒株特征，选择一份样本进行完整的S 基因扩增，并进行测序。所获得序列命名为CH∕TP-2-2，S 基因全长为4 146 bp，编码1 381 个氨基酸，已将序列上传至GenBank MK140811。通过与参考毒株进行序列比对分析，证实扩增的片段是PEDV。同源性分析显示，本研究所获得PEDV 流行毒株的CH∕SCCZ∕2018 和CH∕GZJP∕2017 等毒株同源关系最近，同源性为98%，而与经典毒株CV777 株的同源性有94.9%。

2.4 遗传进化分析 遗传进化树显示，本研究所获得PEDV 流行毒株与OH851、CH∕SCCZ∕2018 和CH∕GZJP∕2017 等毒株聚在一支。参考文献对PEDV 毒株的分型，确定本试验所获得PEDV 流行毒株为G1c 型（图2），而与CV777 和AJ1102 等经典毒株相距较远，说明PEDV 一直处于遗传进化中。■

图2 PEDV S基因的遗传进化树