昆明地区脂肪肝痰瘀证候ZJU指数及基因多态性研究*

杨 艳 ，洪 力 ，韦姗姗 ，2，姚 政 ，3，季能博 ，徐 寻 ，吕一航 ，王维 ，2，3△

（1.云南中医药大学，云南 昆明 650500；2.云南省中医药学分子生物学重点实验室，云南 昆明 650500；3.云南省高校中医证候微观辨证重点实验室，云南 昆明 650500）

脂肪肝（fatty liver disease，FLD）是临床常见的以代谢障碍为病理表现的肝脏疾病[1]。根据饮酒是否过量，FLD可分为酒精性脂肪性肝病（alcohol fatty liver disease，AFLD）和非酒精性脂肪性肝病（non-alcohol fatty liver disease，NAFLD）。FLD 是一种慢性疾病，在临床工作中，由于患者生活习惯等原因，不易精确鉴别NAFLD与AFLD，但在患病率程度上NAFLD可反映FLD的流行状况[2]。

中医一般将脂肪肝被归入“积聚”“肥气”“癥瘕”等病的范畴中[3]。其病因常常被认为与过食膏粱厚味、饮酒等生活习惯及遗传有关。饮食不节导致脾失健运，痰湿内生，痰湿困脾，则肝亦受伐，肝失疏泄，导致气机不畅，最终痰湿为患。痰湿日久积滞，气行不利、血行不畅而成瘀。故痰瘀相关证候为脂肪肝常见证候。从现代基础医学角度上看，脂肪肝患者痰瘀证候的形成与机体胰岛素抵抗引起的糖脂代谢紊乱及其病理产物关系紧密[4]。大量流行病学研究均显示脂肪肝患者在诸如血糖、血脂、血液流变学等血生化指标上存在明显异常[5-7]。

ZJU指数[8]是浙江大学根据生化指标结合中国人体质提出适用于中国人的非酒精脂肪肝确诊的一个指数。相比于脂肪肝指数（Fatty liver index，FLI）[9]，更适合于中国人的具体情况[8]。ZJU指数=BMI（kg/m2）+FPG（mmol/L）+TG（mmol/L）+3 × ALT/AST（如果是女性则+2）[10]。该指数小于32不容易出现脂肪肝，大于38容易出现脂肪肝。影响ZJU指数的参数包括了与糖、脂代谢及肝功能相关的指标，这些指标的差异除了与患者个人生活习惯相关外，也受到糖脂代谢基因的遗传背景的影响。因此，这一参数的设计理念与中医对该疾病的认识具有较高相似度。

脂质代谢基因多态性作为直接影响机体脂质代谢稳态和FLD发生发展的关键因素，近年来一直是探讨FLD发病机制的研究热点。如马铃薯糖蛋白样磷酸酶（Patatin Like Phospholipase Domain Containing 3，PNPLA3）第二外显子 rs738409（I148M）的突变会通过减缓细胞内甘油三酯的水解速度，促进甘油三酯在肝内的沉积[11-14]，且基因型的频率与非酒精性脂肪肝发病率的流行病学调查结果相吻合[15]。脂联素（Adiponectin，APN）基因第一外显子rs2241766（T45G）、内含子 rs1501299（G276T）的突变可能通过降低血清脂联素水平而导致胰岛素抵抗加剧，破坏体内脂质代谢稳态。瘦素（Leptin，LEP）基因启动子上游rs7799039（G-2584A）位点，瘦素受体（Leptin receptor，LEPR） 基因第一外显子 rs1137100（K109R）位点突变则会通过影响瘦素表达水平及瘦素与受体相互作用加剧胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱。所以，基于这些基因突变导致的糖脂代谢紊乱的病理产物，从基因多态性角度探讨遗传背景与脂肪肝痰瘀证候之间的关系是可行且必要的。

昆明地处云贵高原，是多民族聚集的省会城市，城镇人口脂肪肝发病率相对较高，且痰瘀相关证候人群比例高，因此，本研究通过分析中国云南昆明地区人群中痰瘀证型（痰瘀互结、痰湿内阻）FLD患者与对照者之间血液生化指标、ZJU指数、相关基因多态性与脂肪肝之间的关系，进一步探讨多态性差异与生化指标对脂肪肝患者中医辨证分型的参考意义，为痰瘀证型FLD的早期预测、诊断及治疗提供依据。

1 对象和方法

1.1 对象 痰瘀证型FLD病例组40例，均来自2018年10月至2019年2月云南省中医院、昆明市中医院、云南中医药大学院第一附属医院滇池体检中心就诊患者，诊断均符合中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组2010年修订的脂肪肝诊断影像学标准诊断，中医辨证分型属于痰湿内阻证型或痰瘀互结证型，同时排除信息填写不完整者或缺失者和生命体征不稳定或临床诊断为先天性代谢异常综合症、免疫系统疾病、病毒性肝炎、肝胆胃肠疾病、癌症及手术和严重药物依赖者；无FLD对照组40例，均来自同期在体检中心体检的健康人群。所有研究对象彼此间无亲缘关系。所有入组者知情同意并签署知情同意书。

1.2 临床及血液生化指标检测

1.2.1 临床指标检测 记录患者年龄、性别，测量身高、体质量，计算体质指数（body mass index，BMI）。

1.2.2 血液生化指标检测 血液采集：患者于采血前一晚20：00开始空腹12 h以上，次日空腹采集静脉血，使用全自动生化仪检测谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）、空腹血糖（FPG）的含量。另采集5 mL静脉血于抗凝管保存于-80℃冰箱内，用于基因组DNA提取。

1.3 基因组DNA提取及测序分型

1.3.1 提取全基因组DNA 采用AXYGEN全血基因DNA试剂盒快速提取基因组DNA，提取得到的基因组DNA置于-80℃冰箱内保存备用。

1.3.2 基因多态性检测 对保存备用的DNA样本进行纯度和完整性检测，对其进行扩增。PCR反应体系（50 μL） 如下：10 × PCR Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，引物（F+R）各 2 μL（引物序列见表 1），Taq 酶 1μ L，基因组 DNA 2 μL，ddH2O 补足 50 μL。PCR 反应条件：预变性 94℃ 10 min→变性 94℃ 30 s→退火（APN T45G、APN G276T、LEP G-2548A、PNPLA3 I148M 为57.5℃，LEPR K109R 为 55℃）→延伸 72℃ 1 min→最后72℃延伸10 min，30个循环。扩增产物由昆明擎科生物有限公司进行基因位点的测序，对返回的结果进行分析。

表1 基因引物序列

1.4 统计学处理方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。计数资料使用频数（n）和百分比（%）描述；计数资料的统计分析使用χ2检验；二分类资料的多因素分析使用二元Logistic回归分析。检验水准α=0.05，P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ZJU指数对比 本地区的之前有横断面调查显示，ZJU指数具有良好的甄别脂肪肝人群的功能，对中医证候的分型也是有一定的区分功能，是一个具有指导意义的指标。本次调查的ZJU指数显示，正常组与痰瘀证型FLD病例组存在显著差异（P<0.05），如表2所示。与前期研究对比发现，本次调查中的痰瘀证型FLD组ZJU指数与前期研究中痰瘀互结、痰湿内阻证候的ZJU指数接近[16]，本次选取的样本具有代表性。

表2 ZJU指数水平对比（±s）

表2 ZJU指数水平对比（±s）

注：与正常组比较，*P<0.05。

分组 例数 ZJU指数正常组 40 33.26±2.83痰瘀证型FLD病例组 40 37.82±4.97*

2.2 生化指标对比 将ZJU指数中所涉及的生化指标逐一统计后发现，脂肪肝组和正常组在BMI和FPG两个指标上差异具有统计学意义（P<0.05）。同时，将ZJU指数计算中未包含但可能是FLD危险因素的生化指标进行统计，结果显示LDL和HDL在两组间差异具有统计学意义（P<0.05），如表3所示。ZJU指数可作为鉴别中医证型的一种辅助指标，但区分具体证型时需加入其它指标，如LDL和HDL。

表 3 ZJU 生化指标对比情况（±s，n=40）

表 3 ZJU 生化指标对比情况（±s，n=40）

注：与正常组比较，*P<0.05。

Z J U含有的Z J U未含的T G/（m m o l·L-1）2 3.8 6±2.0 4 4.9 3±0.4 0 1.7 7±1.1 4 1.1 7±0.2 6 3.0 0±0.7 1痰瘀证型F L D病例组组别B M I/（k g·m-2）F P G/（m m o l·L-1）A L T/A S T L D L/（m m o l·L-1）H D L/（m m o l·L-1）正常组1.0 4±0.3 6 2 5.6 2±3.1 7* 7.3 9±3.1 6* 2.0 7±0.8 9 1.0 2±0.3 6 T C/（m m o l·L-1）4.8 7±0.7 9 5.0 9±1.0 8 1.3 2±0.2 3* 2.6 4±0.7 2*

2.3 FLD相关基因多态性分析 生化指标的差异提示，在糖、脂代谢方面，脂肪肝组和正常组均存在差异，糖脂又和现代中医研究中的“痰”有着一定的相似性[17]。在与脂肪肝形成关系密切的基因中，PNPLA3是最强的遗传危险因子[18-19]，LEP与BMI指数相关[20-21]，APN、APN与FPG相关[22]，LEPR与胰岛素抵抗密切相关[23]，胰岛素抵抗又与NAFLD痰瘀证型有关[24]。对这些基因的多态性位点进行检测后发现，LEPR K109R和PNPLA3 I148M存在基因多态性差异（P<0.05），如表 4 所示。

表4 脂肪肝相关基因多态性位点基因型和等位基因的分布

研究结果显示基因的突变与否可能和生化指标的改变存在一定的联系，但生化指标的改变更有可能是多个方面共同作用的结果，单个基因只能影响一部分的结果。由于本次FLD样本的来源均为“痰瘀”相关证型病例，故推断LEPR K109R和PNPLA3 I148M两个基因多态性位点的差异可能在FLD痰瘀相关证候形成过程中发挥重要作用，这两个基因可能是中医痰瘀证候的生物学基础之一，但单个基因的差异可能并不是FLD的发生及证候转归的决定性因素。

3 讨论

FLD在中医学主要被归入“积聚”“肥气”“癥瘕”范畴。诚如《灵枢·邪气藏府病形》云：“肝脉……微急为肥气，在胁下，若复杯。”FLD的发生与遗传、生活习惯密切相关，如膏粱厚味、饮酒等都是其病因。病位与肝、脾相关，初期病机多为肝郁脾虚，如《伤寒论浅注补正》所载：“湿者，脾之本气也，土之有湿，则为膏壤，脾秉湿气，是生膏油”。因此在生理状态下脾主运化，水谷精微通过脾的输布，滋润五脏六腑、四肢百骸，维持着人体的正常生命活动；若饮食不节导致脾失健运，则痰湿内生，痰湿又困脾，形成恶性循环。《血证论·脏腑病机论》云：“食气入胃，全赖肝木之气以疏泄之。”因此脾被痰湿所困，则肝亦受伐，肝失疏泄，导致气机不畅，最终痰湿为患。痰湿日久则郁而化热，形成痰热互结之证。痰湿积滞，气行不利、血行不畅而成瘀，或痰热日久深入血分，血热相搏，煎灼血中津液，以致血行不畅，终变为痰瘀互结之证。《金匮要略》云：“血不利则为水，水聚则成痰”，指出湿痰瘀互为致病因素[24-25]。因此FLD初期以肝脾失职为主要病因，进而痰湿内生，最终形成以肝郁脾虚为本，痰瘀互结为标的本虚标实之证。

目前关于脂肪肝形成的原因较为一致的是“多次打击”学说[26]。其中葡萄糖和血脂代谢紊乱是脂肪肝形成的重要因素之一。ZJU指数是多个指标进行计算后得出复合指标，能较为全面地体现人体整体代谢情况，且通过大数据验证，并在本地区不同人群中可以较为精准地诊断脂肪肝，但在区分不同证候间的指导性略显不足。课题组前期调查显示，NAFLD痰湿内阻型和痰瘀互结型分别占调查总数的25.3%和14.6%，总体比例接近40%，推测可能跟本地区人群饮食结构、遗传及情志有关。

将本次调查的ZJU指数与痰湿内阻型和痰瘀互结型脂肪肝做二元Logistic回归分析，以ZJU指数低于32作为参考量，80名被调查者中，对照组ZJU小于32的有11人，痰瘀证型FLD病例组ZJU小于32的有2人。对照组与痰瘀证型FLD病例组中ZJU指数有统计学意义（χ2=15.776，P＜0.05）。Logistic 回归模型显示，ZJU 指数在 32～38的人（OR=4.87，95%CI：0.98～24.29）和ZJU指数大于38的人发生脂肪肝的风险增加（OR=27.50，95%CI：3.91～193.49）。考虑将优化后的基因多态性等遗传性因素纳入后进行关联分析，来进一步优化ZJU指数的指导作用。

对本次调查存在统计学差异的因素做二元Logistic回归分析，具体为 ZJU 指数、BMI、FPG、LDL、HDL、LEPR K109R多态性位点、PNPLA3 I148M多态性位点，进行脂肪肝的多因素二元Logistic回归分析，分别以ZJU指数低于32、BMI小于25、FPG小于6.1、LDL 小于 3.12、HDL 大于 1.04、LEPR K109R 基因型AA、PNPLA3 I148M基因型CC为参考量，由于样本量大小及共线性问题建立的模型不稳定，只有FPG纳入了进入回归方程，80名调查者中，对照组FPG正常者39例（97.5%），痰瘀证型FLD病例组FPG正常者18例（55%）。对照组与痰瘀证型FLD病例组中 FPG异常率有统计学意义（χ2=31.580，P＜0.05）。Logistic回归模型显示，FPG高于正常范围的人相对于FPG在正常范围的人，发生脂肪肝的风险增加（OR=47.67，95%CI：5.95～381.69）。这个结果提示生化指标的异常并不能完全作为脂肪肝的危险因素，脂肪肝的形成可能使多个遗传基因和环境因素共同作用的结果。单个基因的作用可能具有局限性。但基因的突变很有可能是更加危险的因素，需要在后续的检测中给与一定的权重。

目前一些专家认为对脂肪性肝病的命名并不准确，他们认为脂肪肝的形成涉及人体整体代谢，并与遗传和环境因子相关[27-28]，这与中医的整体观念和ZJU指数的多指标复合相契合。笔者认为将遗传背景因素纳入到ZJU指数的研究具有积极意义，可以作为中医证型客观化的潜在研究指标。但由于ZJU指数与糖脂代谢及肝功有关，在纳入基因上，可能需要与这些指标相关。例如，本研究选择的脂联素（Adiponectin，APN）基因又称 28ku胶原结合蛋白（GBP28），是一种由脂肪组织合成并分泌的蛋白质类激素，具有缓解胰岛素抵抗、降低细胞内甘油三酯（TG）的作用，提示APN通过影响机体胰岛素抵抗机制从而影响FLD痰瘀证型的发生与发展。瘦素（Leptin，LEP）是由脂肪组织分泌的蛋白质类激素，其分泌量与人体的体脂含量成正比。临床研究也表明，高LEP水平可降低胰岛素抵抗、减少肝细胞的脂肪变性[29]。瘦素受体（Leptin receptor，LEPR）属Ⅰ类细胞因子受体家族，可通过与瘦素结合，为瘦素发挥生理功能起介导作用。LEP信号对胰岛素具有拮抗作用，若其作用受到抑制，则可诱发胰岛素抵抗、促使肝细胞脂肪变性的发生，提示LEP与LEPR可能与脂肪肝痰瘀证型具有相互关系。马铃薯糖蛋白样磷酸酶（PNPLA3）又称为脂肪营养素重组蛋白，该基因编码了一个由481个氨基酸组成表达于与脂滴直接接触的内质网表面的跨膜蛋白。过量游离脂肪酸存在的条件下，人肝细胞过表达PNPLA3突变型可减缓细胞内甘油三酯的水解速度，促进甘油三酯在肝内的沉积[11-14]。该基因的突变所导致的病理产物也与痰瘀证候相关。但是，由于ZJU指数涉及的代谢过程及基因较多，若考虑中医分型的准确性，则需要在更大样本范围的基础上评估纳入的基因数量，并进行权重优化。后续笔者团队将扩大样本量，充分研究ZJU指数和基因多态性联合对中医证型的指导作用，让该指数可以作为中医证型客观化的参考指标。