基于响应面法的醇提取黄芪皂苷工艺的优化

赵瑛璐 贾丽艳 郭晓俊 赵书田 梁建萍

1（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷 030801）

2（山西省白酒生物工程研究生教育创新中心，山西太谷 030801）

3（山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801）

黄芪（Astragalus membranaceus）为豆科植物膜荚黄芪的干燥根，是一种常用的中药材。黄芪味甘，不仅能增强免疫力，还具有补气固表、托毒生肌、利水消肿的功效。黄芪中含有较为丰富的黄酮、多糖、皂苷、氨基酸、生物碱、有机酸、微量元素以及叶酸、亚油酸、胆碱、甜菜碱、香豆酸等化学成分，其中黄酮类、多糖类、皂苷类物质是主要的天然活性物质。黄芪的应用前景十分广阔，目前研制出的黄芪类产品，主要为药品，包括黄芪注射液、黄芪口服液、黄芪胶囊、复方黄芪鼻腔喷雾剂等。2020 年，国家卫生健康委员会、国家市场监管总局联合发布了《关于对党参等9 种物质开展按照传统既是食品又是中药材的物质管理试点工作的通知》，黄芪在9 种物质之列，这标志着黄芪有望被纳入“药食同源”目录。在未来，黄芪的价值会被进一步开发，以黄芪为原料的食品也可能会逐渐走进大众视野。

黄芪在我国主要分布在北方地区，山西、河北、山东、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、青海、新疆等省区均有分布。由于各地的地理环境和气候条件不同，黄芪的质地及功效也有区别，其中，山西浑源黄芪在省内外比较有名。浑源黄芪，别名正北芪、恒山黄芪，具有“中国黄芪在山西，浑源黄芪甲天下”的美誉。浑源黄芪具有色泽黄亮、粉大、药性强、空心小、品种纯、无污染等特点。因此，研究浑源黄芪中的功能性物质，对其开发利用具有一定的意义。

黄芪皂苷是黄芪的主要功能成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗肿瘤、强心、调节免疫等多种药理活性，在心血管、消化、泌尿、血液、内分泌、免疫等系统疾病治疗中发挥重要作用。目前，从黄芪及其同属性植物中分离出的三萜皂苷已达40 余种，主要有黄芪皂苷（Ⅰ-Ⅶ）、异黄芪皂苷（Ⅰ、Ⅱ）、乙酰基黄芪皂苷（Cyclocephaloside Ⅱ）、大豆皂苷（TrojanosideA、H）等四大类，总称黄芪皂苷或黄芪总皂苷。

黄芪皂苷含量是评价以黄芪为主药或含黄芪的中药制剂配方质量的主要指标。浑源黄芪最大的特点是总皂苷含量高。本研究以浑源黄芪为原料，以提取液中黄芪皂苷含量为测定指标，通过单因素及响应面Box-Benhnken 试验优化提取黄芪皂苷的工艺条件，为浑源黄芪在医药及食品领域的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

浑源黄芪。

1.2 试剂

香草醛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸，成都市科隆化学品有限公司；无水乙醇，分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；黄芪总皂苷，分析对照品，上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 主要仪器

HH-3A型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；YXQ-LS-75SⅡ-01-00型立式压力蒸汽灭菌锅，上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；YP6002B型电子天平，上海力辰邦西仪器科技有限公司；SC-3612型低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；超声波粉碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.4 方法

1.4.1 单因素试验

采用单因素试验研究乙醇体积浓度、料液比、浸提时间、浸提温度对提取液中黄芪皂苷含量的影响。

将黄芪清洗烘干后粉碎至40 目。称取一定量黄芪粉，分别在不同乙醇体积浓度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25），浸提时间（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）和浸提温度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）条件下，浸提黄芪皂苷。将获得的黄芪浸提液，于3 500 r/min 离心20 min，取上清液，测定黄芪皂苷含量。

1.4.2 响应面法优化黄芪皂苷提取工艺

在单因素试验结果的基础上，选取乙醇浓度（A）、液料比（B）、浸提时间（C）、浸提温度（D）为考察因素，以黄芪皂苷含量为响应值，采用响应面法进行Box-Behnken 设计法设计响应面试验，用Design Expert 8.0.6 进行试验数据分析，进而优化黄芪皂苷工艺条件。响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平

1.4.3 对照品溶液的制备

精密称取5.0 mg 黄芪皂苷标准品置于具塞试管中，用无水乙醇溶解并定容至10 mL，于超声波粉碎仪中溶解，摇匀，即得质量浓度为0.50 mg/mL皂苷标准溶液。

1.4.4 黄芪浸提液的制备

将黄芪清洗烘干后粉碎至40 目，称取1 g 黄芪粉末于三角瓶中，以单因素设计的乙醇体积浓度、料液比、提取温度和提取时间提取黄芪皂苷，3 500 r/min 离心20 min，取上清液，备用。

1.4.5 黄芪皂苷含量测定

采用香草醛一硫酸分光光度法测定。

精密吸取质量浓度为0.50 mg/mL 的黄芪皂苷标准溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL，置于具塞试管中，加无水乙醇补足体积至0.5 mL，再分别加入0.5 mL 8 %的香草醛-无水乙醇试液和5.0 mL 72%的硫酸摇匀，立即放入62 ℃恒温水浴中，保温20 min，置冷水浴中冷却至室温，于540 nm 波长处测吸光度。同时以随行试剂作空白。

吸取0.2 mL 黄芪浸提液，按照上述方法进行操作，测得吸光度值，根据标准曲线计算出黄芪浸提液中皂苷的含量。

2 结果与分析

2.1 黄芪皂苷标准曲线

以黄芪皂苷含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线见图1。得到黄芪皂苷含量测定的线性回归方程为：y=4.013 1x+0.003 2，R2=0.999 2。

图1 皂苷标准曲线

2.2 乙醇体积浓度对黄芪皂苷提取效果的影响

乙醇体积浓度对黄芪皂苷提取效果的影响如图2 所示。

图2 乙醇体积浓度对黄芪皂苷提取效果的影响

由图2 可知，随着乙醇体积浓度的增加，浸提液中黄芪皂苷含量先增大后减小。当乙醇体积浓度达到80%时，黄芪浸提液中皂苷含量最高；当乙醇体积浓度超过80%时，黄芪浸提液中皂苷含量降低，表明浸提黄芪皂苷的最适乙醇体积浓度为80%。

2.3 料液比对黄芪皂苷提取效果的影响

料液比对黄芪皂苷提取效果的影响如图3 所示。

图3 料液比对黄芪皂苷提取效果的影响

由图3 可知，随着料液比增加，提取液中黄芪皂苷含量呈现先上升后下降的趋势。当料液比为1：10 时，皂苷含量最高。可能是增加料液比，增加黄芪粉末与溶液的接触面积，有效成分的扩散速率得到提升，料液比为1∶10 时，有效成分析出量最大。料液比继续增加，会溶解出更多非黄芪皂苷成分，造成干扰。因此选择最佳料液比为1∶10。在该比例下，既能保证黄芪皂苷含量最高，又可以有效节约成本。

2.4 浸提时间对黄芪皂苷提取效果的影响

浸提时间对黄芪皂苷提取效果的影响如图4所示。

图4 浸提时间对黄芪皂苷提取效果的影响

由图4 可知，随着浸提时间的增加，黄芪皂苷溶解，黄芪皂苷含量增加，但浸提时间继续增加，会导致皂苷浓度减少，说明浸提1.5 h 时黄芪皂苷已经溶解。继续浸提会导致杂质增多，影响皂苷含量，导致含量减少。所以最佳浸提时间为1.5 h。

2.5 浸提温度对黄芪皂苷提取效果的影响

浸提温度对黄芪皂苷提取效果的影响如图5所示。

图5 浸提温度对黄芪皂苷提取效果的影响

由图5 可知，随着浸提温度的升高，浸提液中黄芪皂苷含量先增加后降低。当浸提温度为50 ℃时，黄芪皂苷的含量高于其他水平的皂苷含量。因此，选择最佳浸提时间为50 ℃。

2.6 响应面法优化提取工艺

响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验结果

续表

对表2 数据进行多元回归拟合分析，得到黄芪皂苷含量与乙醇体积浓度（A）、液料比（B）、浸提时间（C）、浸提温度（D）的二次方程模型为：皂苷含量为12.15-0.090A-0.063B-0.045C-0.044D +0.11AB+0.031AC-0.051AD-0.12BC+0.023BD-0.066CD-3.83A2-2.04B2-1.11C2-0.47D2。黄芪皂苷响应面试验回归模型方差分析见表3。

表3 黄芪皂苷响应面试验回归模型方差分析

由表3 方差分析可知，黄芪皂苷含量回归模型显著性检验P＜0.000 1，模型极显著；黄芪皂苷含量回归模型失拟性检验P=0.991 9＞0.05，说明方程失拟不显著。该方程对试验拟合性较好，模型能够真实的反映试验数据。决定系数R2=99.96%，校正决定系数R2Adj=99.92%，说明模型与实际试验拟合度良好，可以用来对试验结果进行初步的分析预测。根据回归方程的方差分析得知，各因素对黄芪皂苷含量影响的主次顺序为乙醇体积浓度＞料液比＞浸提时间＞浸提温度。一次项A、B，交互项AB、BC 以及二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项C、D 以及交互项CD 对结果影响显著，其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。

根据回归模型，得到最佳的提取条件为：乙醇体积浓度79.82%，料液比1∶9.93，浸提时间1.49 h，浸提温度49.55 ℃。在此条件下，黄芪皂苷含量理论上为12.16 mg/mL。结合实际和考虑试验的局限性，对条件进行完善，选择乙醇体积浓度80 %，料液比1∶10，浸提时间1.5 h，浸提温度50 ℃。经过3 次重复试验验证，得到黄芪皂苷含量为（12.20±0.047）mg/mL。

各影响因素交互作用的响应面及等高线见图6。AB、AC、AD、BC 都有明显交互作用，尤其AB 响应面曲线走势较陡，交互作用较显著，有明显最高点和最优水平。

图6 各因素交互作用对黄芪皂苷含量的影响

3 结论

通过单因素和响应面优化试验，确定醇提浑源黄芪皂苷最优条件为：乙醇体积浓度80%，料液比1∶10，浸提时间1.5 h，浸提温度50 ℃，得到黄芪皂苷含量（12.20±0.047）mg/mL。该工艺可行性高，操作简单，以乙醇为溶剂，成本低，可用于浑源黄芪皂苷的提取。以上研究为浑源黄芪皂苷提取及开发提供了技术支撑。