清热润燥口服液对哮喘小鼠ILC2s上下游细胞因子的影响

伍林泽，胡旭红，傅榕冰，魏义杰，虎 敏，孔令麒，童晓云，吴向农，吴佳丽，聂 坚，张绍湘，虎春艳，李宝晶，魏丹霞*，黄 丰*

(1.云南中医药大学，昆明 650500；2.腾冲市中医医院，云南 腾冲 679100；3.云南中医药大学第一附属医院，昆明 650021；4.云南中医药大学第三附属医院，昆明 650011)

支气管哮喘简称哮喘(asthma)，是一种临床上常见、多发和难愈的慢性呼吸系统疾病。近年来，在基因、环境和过敏原等因素的相互作用下哮喘的发病率和死亡率逐年升高，目前全球范围内有3~4亿哮喘患者，我国成年人中哮喘患者已达到4570万人，对人类健康构成巨大的威胁[1]。哮喘的发病机制复杂，且由多种炎性细胞和细胞因子参与，其中嗜酸性粒细胞趋化因子Eotaxin，可以激活嗜酸性粒细胞并将其募集到肺中，导致患者气道重塑和气道高反应性加重[2]。此外，最新研究表明先天性免疫细胞中的固有淋巴样细胞(innate lymphoid cells，ILCs)在哮喘的发病过程中也具有重要作用[3]。来自于骨髓造血干细胞中淋巴样前体细胞的ILCs中的Ⅱ型固有淋巴细胞(typeⅡinnate lymphoid cells，ILC2s)，在过敏性鼻炎和哮喘等疾病中的表达水平显著升高。当肺部受到多种炎症因素的刺激时，上皮源性细胞因子IL-33(interleukin-33)、IL-25(interleukin-25)、胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)大量分泌，并且刺激ILC2s表达2型T辅助淋巴(Th2)细胞因子IL-4(interleukin-4)和IL-5(interleukin-5)及促炎因子IL-6(interleukin-6)[4－5]，引起Th2型免疫反应，加重哮喘的气道炎症，从而促进哮喘的发生。

哮喘属于中医哮证范畴，其发病机制在中医论述里分为夙根学说，肺虚、脾虚、肾虚学说和外邪学说等[6]。在夙根学说中宿痰伏于肺，说明肺部是哮喘发病的主要部位，痰是哮喘发病的主要病理因素。云南省荣誉名中医陆家龙认为治疗慢性气道炎症性疾病，要“养润与通利”并行，并根据此观点研制出清热润燥口服液。临床证明，该方具有清肺养阴和润肺止咳等药效，以及安全有效的特点，用于治疗慢性支气管炎急性发作和咽炎等疾病，已在临床上使用了30余年[7－8]。本实验旨在通过清热润燥口服液对OVA致敏的哮喘小鼠的趋化因子和ILC2s数量及上下游细胞因子的影响，探讨该方干预哮喘小鼠的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

实验动物采用健康的清洁级BALB/c雌性小鼠40只，6~8周龄，体重(20±2)g，购自辽宁长生生物技术股份有限公司[SCXK(辽)2015-0001]，实验动物质量合格证号为No.211002300051473，动物饲养于云南中医药大学实验动物中心[SYXK(滇)K2017-0005]，实验经云南中医药大学实验动物伦理审查委员会批准(R-06202035)，并按照实验动物使用的3R原则给予人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器

组成清热润燥口服液的桑叶、苦杏仁、浙贝母、南沙参、麦冬、芦根、薏苡仁、陈皮、茯苓、冬瓜仁、京半夏、炒谷和炒麦芽均购于云南白药集团，并委托云南中医药大学第三附属医院制剂室制备提供(4.1 g/mL原生药)，药物保存于4℃备用；地塞米松和卵清蛋白(OVA)(美国Sigma公司，批号分别为:BCBV3214、9006-59-1)；Al(OH)3粉末(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号:38701)；小鼠Eotaxin、IL-4、IL-5、IL-6、IL-33和TSLP酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(联科生物技术有限公司，批号分 别 为:2213080441、2213080441、A20580821、A20680724、A23380314、A26580933)；小鼠IL-25(IL-17E)ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司，批号:181225-007a)；仓鼠抗小鼠CD3ε抗体、大鼠抗小鼠CD4抗体、仓鼠抗小鼠CD11c抗体、大鼠抗小鼠Ly-6G和Ly-6C(Gr-1)抗体、大鼠抗小鼠CD5抗体、大鼠抗小鼠CD19抗体、小鼠抗NK1.1抗体、大鼠抗小鼠CD8α抗体(美国BD Pharmingen公司，批 号 分 别 为:553060、553728、553800、553125、553019、553784、553163、553163)；Biotin anti-mouse FceRIα(美国BioLegend公司，批号:134304)；Biotin rat anti-mouse TER119和Anti-mouse F4/80 antigen biotin(美国eBioscience公司，批号分别为:13-5921-81、13-5921-81)；Liberase TM和DNase I(瑞士Roche公司，批号分别为:35537400、35027800)；GATA3和IL-33抗体(武汉Proteintech公司，批号分别为:66400-1-Ig、12372-1-AP)；IL-5抗体(美国Signalway公司，批号为:31306-1)；KLRG1抗体(美国Fitzgerald公司，批号为:70R-18166)。超声雾化器(德国百瑞公司，型号:INQUA NEB plus)；玻片扫描影像系统(深圳市生强科技有限公司，型号:Teksqray SQS-1000)；酶标仪(美国美谷分子，型号:Spectra Max plus384)；－80℃超低温冰箱(美国赛默飞世尔科技公司，型号:8920)；正置光学显微镜、成像系统(日本尼康公司，型号分别为:Nikon Eclipse E100、NIKON DS-U3)；流式细胞检测仪(美国BD公司，型号:LSRF ortessa)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组

实验将BALB/c小鼠(雌性)分为5组，每组8只，空白对照组(C组)、模型对照组(M组)、阳性对照组(地塞米松，DEX组)、清热润燥口服液低剂量组(QRRZ-L组)、清热润燥口服液高剂量组(QRRZH组)。

1.3.2 哮喘模型建立及给药方法

于开始建立模型的第1、8、15天，采用腹腔注射的方式，C组每只注射生理盐水0.2 mL，其余各组每只注射OVA混悬液(OVA和Al(OH)3配制，浓度分别为:1、5 mg/mL)0.2 mL致敏。第21天开始采用灌胃的方式给药7 d，每天1次，C组和M组为生理盐水(10 mL/kg)，DEX组为地塞米松溶液(1 mg/(kg·d))，QRRZ-L和QRRZ-H组分别为低(4.32 g/(kg·d))、高(8.64 g/(kg·d))剂量的清热润燥口服液。给药1 h后进行雾化，除C组使用生理盐水雾化外，其余各组使用2%OVA雾化液雾化激发1周(每天每次30 min)。

1.3.3 收集肺泡灌洗液

第28天，1%的戊巴比妥(0.01 mL/g)麻醉小鼠，随后取血处死，开颈部暴露气管，并进行插管，打开胸腔，用动脉夹将右支气管夹闭，用0.3 mL PBS缓冲液抽吸灌洗右肺3遍，灌洗2次后收集。于1000 r/min，4℃离心10 min，取上清液严格按照试剂盒说明书操作步骤检测BALF中Eotaxin、IL-25、IL-33、TSLP、IL-4、IL-5和IL-6的含量。

1.3.4 采集肺组织

收集完肺泡灌洗液后，取右肺中叶用PBS漂洗血液后，于滤纸上吸干残留液体，浸泡于中性甲醛组织固定液中，浸泡36 h后将肺组织用石蜡包埋后切片，进行苏木精-伊红染色(HE染色)、免疫组化染色和免疫双荧光染色；取肺上下叶置入预冷的PBS中，剪碎成小于0.5 cm×0.5 cm的碎块后，加入Liberase TM和DNase I于37℃静置消化1 h后研磨，制成单细胞悬液后进行流式检测肺组织ILC2s的数目。

1.4 统计学方法

实验数据通过SPSS 20.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析和t检验的方法进行多组间及组间差异比较，并以P<0.05和P<0.01表示实验结果有显著性差异，数据分析结果以平均数±标准差(±s)表示，并用GraphPad Prism 8软件进行作图。

2 结果

2.1 HE染色观察肺组织病理改变

HE染色结果显示:空白对照组肺组织支气管结构清晰完整，黏膜上皮细胞完整无脱落且排列整齐，几乎没有炎性细胞浸润；模型对照组较空白对照组相比支气管壁增厚，支气管上皮破坏不完整且气管炎性细胞浸润严重；阳性对照组和清热润燥口服液低高剂量组较模型对照组相比气道周围的炎性细胞浸润和支气管壁增厚特征有所减轻，如图1所示。

图1 清热润燥口服液对哮喘小鼠肺组织病理变化的影响(HE染色)Figure1 EffectofQingreRunzaooralliquidonpathological changesoflungtissueinasthmaticmice(HEstaining)

2.2 ELISA检测BALF中Eotaxin、IL-25、IL-33、TSLP、IL-4、IL-5及IL-6的含量

2.2.1 清热润燥口服液对哮喘小鼠BALF中Eotaxin含量的影响

如图2所示，模型对照组BALF中Eotaxin的含量与空白对照组相比明显升高，具有显著性差异(P<0.01)；与模型对照组相比，阳性对照组和清热润燥口服液高低剂量组均可使Eotaxin的含量降低，具有显著性差异(P<0.01)。

图2 清热润燥口服液对哮喘小鼠Eotaxin的影响(±s，n＝8)Figure2 EffectofQingreRunzaooralliquidon Eotaxininasthmaticmice

2.2.2 清热润燥口服液对哮喘小鼠BALF中IL-25、IL-33、TSLP含量的影响

如图3所示，模型对照组BALF中IL-25、IL-33、TSLP的的含量与空白对照组相比，明显升高，具有显著性差异(P<0.01)；与模型对照组相比，阳性对照组和清热润燥口服液高低剂量组均可使IL-25、IL-33、TSLP的含量降低，具有显著性差异(P<0.01)。

图3 清热润燥口服液对哮喘小鼠ILC2s上游细胞因子的影响(¯x±s，n＝8)Figure 3 Effect of Qingre Runzao oral liquid on cytokines upstream of ILC2s in asthmatic mice

2.2.3 清热润燥口服液对哮喘小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-6含量的影响

如图4所示，模型对照组BALF中IL-4、IL-5和IL-6的含量与空白对照组相比明显升高，具有显著性差异(P<0.01)；与模型对照组相比，阳性对照组和清热润燥口服液高低剂量组均可使IL-4、IL-5和IL-6的含量降低，具有显著性差异(P<0.01)。

图4 清热润燥口服液对哮喘小鼠ILC2s下游细胞因子的影响(¯x±s，n＝8)Figure 4 Effect of Qingre Runzao oral liquid on cytokines downstream of ILC2s in asthmatic mice

2.3 免疫组化法检测肺组织中ILC2s上下游细胞因子IL-33及IL-5的表达

2.3.1 清热润燥口服液对哮喘小鼠肺组织中ILC2s上游细胞因子IL-33表达的影响

如图5所示，模型对照组肺组织中IL-33的表达与空白对照组相比明显升高，具有显著性差异(P<0.01)；与模型对照组相比，阳性对照组和清热润燥口服液高低剂量组均下调肺组织中IL-33的表达，具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。

图5 清热润燥口服液对哮喘小鼠肺组织中ILC2s上游细胞因子IL-33表达的影响(¯x±s，n＝8)Figure 5 Effect of Qingre Runzao oral liquid on the expression of ILC2s upstream cytokine IL-33 in lung tissue of asthmatic mice

2.3.2 清热润燥口服液对哮喘小鼠肺组织中ILC2s下游细胞因子IL-5表达的影响

如图6所示，模型对照组肺组织中IL-5的表达与空白对照组相比明显升高，具有显著性差异(P<0.01)；与模型对照组相比，阳性对照组和清热润燥口服液高低剂量组均下调肺组织中IL-5的表达，具有显著性差异(P<0.01)。

2.4 流式细胞术检测肺组织中ILC2s的数量变化

运用流式细胞术检测清热润燥口服液的高剂量对哮喘小鼠肺组织中ILC2s数量的影响。如图7所示，模型对照组肺组织中ILC2s数量与空白对照组相比明显增高，具有显著性差异(P<0.01)；与模型对照组相比，阳性对照组和清热润燥口服液高剂量组可使肺组织中ILC2s数量降低，具有显著性差异(P<0.01)。

图7 清热润燥口服液对哮喘小鼠肺组织中ILC2s数量的影响(¯x±s，n＝5)Figure 7 Effect of Qingre Runzao oral liquid on the amount of ILC2s in the lung tissue of asthmatic mice

2.5 免疫双荧光染色检测肺组织中ILC2s的生成

免疫双荧光染色法检测GATA3(红)与KLRG1(绿)的表达，确定ILC2s的生成。如图8所示，模型对照组肺组织中ILC2s与空白对照组相比明显增多；与模型对照组相比，阳性对照组和清热润燥口服液高低剂量组均可降低肺组织中ILC2s的生成。

图8 清热润燥口服液对哮喘小鼠肺组织中ILC2s生成的影响Figure 8 Effect of Qingre Runzao oral liquid on ILC2s production in lung tissue of asthmatic mice

3 讨论

清热润燥口服液经过现代工艺加工和临床疗效研究而成，是由桑叶、苦杏仁、陈皮、浙贝母、南沙参、麦冬、芦根、薏苡仁和茯苓等中药组成的复方制剂，其中桑叶归肺、肝经，清肺润燥；苦杏仁归肺经，化痰、止咳和平喘；陈皮归肺、脾经，理气化痰等，方中诸药配伍，共同发挥其药效。在动物实验的研究中表明其具有抗炎、祛痰、止咳和平喘的作用[7－9]，利用高效液相色谱法和紫外分光光度法测定该方的橙皮苷、苦杏仁苷和总多糖的含量[10－12]，对本制剂进行有效的质量控制。本实验使用清热润燥口服液治疗OVA致敏的哮喘小鼠，探索其可能的作用机制，为哮喘疾病的中医药研究提供参考。

支气管哮喘是以气道高反应性、可逆性的气道阻塞和重塑、黏液高分泌和肺功能下降为主要特征的一种肺部炎症，由嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、肥大细胞和上皮细胞参与[13]。哮喘的发病机制尚未完全阐明，其中CD4＋Thelper(Th)细胞的Th1/Th2细胞比例失衡，导致Th2细胞优势应答，产生IL-4、IL-5等炎性因子，引起Th2型免疫反应，是哮喘重要的发病机制[14]。哮喘Th2型免疫反应的主要特征之一是嗜酸性粒细胞增多、迁移和黏液增生[13]，还会产生趋化因子和多种细胞因子，其中趋化因子Eotaxin分子量为8×103~10×103，由73个氨基酸组成，属于CC趋化因子亚家族，是嗜酸性粒细胞的特异性趋化因子，对嗜酸性粒细胞有强大的选择性激活作用。与趋化因子受体CCR3结合后，发挥活化和募集嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞的功能，引起哮喘患者的支气管粘膜和肺泡周围的炎性细胞浸润，导致支气管上皮损伤。还能诱导白三烯、组胺的生成和肥大细胞的迁移分化，参与哮喘的炎症过程[15]。实验中对各组小鼠肺切片进行HE染色，结果显示(图1)，模型对照组小鼠的支气管上皮粘膜破损不完整、支气管壁增厚及大量的炎性细胞浸润，而清热润燥口服液能减轻上述病理特征。

研究表明，先天性淋巴样细胞ILCs(根据分泌的细胞因子不同，分为三类:ILC1s、ILC2s和ILC3s)中的ILC2s与哮喘密切相关。在反式T细胞特异性转录因子(GATA-3)及维甲酸受体相关的孤儿受体α(RORα)的共同调控下产生，分布在肺、血液、脾和骨髓中，并在哮喘患者的外周血和痰液中高表达，可以产生TH2型细胞因子和其他细胞因子，是Th2型免疫反应的主要驱动因素，参与过敏性哮喘和特应性皮炎等疾病过程，调节炎症过程和参与组织修复，在哮喘的发病过程中具有重要作用[16－18]。

ILC2s的表面表达IL-17RB、ST2(也称T1/ST2L)和TSLPR受体，当支气管或肺部受到过敏、病毒、寄生虫和炎症因子的刺激时，分泌IL-25、IL-33和TSLP细胞因子并与ILC2s表面受体结合，产生Th2型细胞因子[16]。IL-1细胞因子家族的IL-33可直接激活ILC2s，是过敏性气道疾病的关键细胞因子，可驱动Th2免疫应答[19]。袁琳洁等[20]利用IL-33滴鼻诱导小鼠哮喘模型，并出现气道高反应性、炎性细胞浸润和肺组织中ILC2s细胞数量增多的现象。IL-33还可通过p38 MAPK信号通路刺激肠系膜脂肪中分离的ILC2s细胞产生IL-5、IL-9等细胞因子，是ILC2s产生细胞因子最重要的激活剂之一[21]。IL-17细胞因子家族的IL-25(也称IL-17E)在哮喘患者的支气管和外周血中较正常人明显升高，临床研究发现，在哮喘患者支气管中随着IL-25的表达量升高，患者的嗜酸性粒细胞气道炎症和气道高反应性加重[22]。IL-25可刺激Th2型细胞因子的表达，还能经鼻腔激发健康小鼠的气道高反应性和气道重塑、杯状细胞和粘膜增生、加重肺支气管和血管周围的嗜酸性粒细胞浸润[23]。IL-2细胞因子家族的TSLP与IL-25和IL-33共同刺激Th2型细胞因子的产生，参与过敏性哮喘的发病过程和对过敏因子的免疫反应[24]。在TSLPR－/－基因缺陷小鼠诱导的哮喘小鼠中，肺中ILC2s的活化和先天性过敏气道炎症反应受到抑制。TSLP和IL-33在体内和体外刺激肺部ILC2s产生彼此的受体，对刺激肺部ILC2s的产生具有协同作用[25]。

在ILC2s的激活下产生IL-4和IL-5等Th2型细胞因子和具有强大促炎作用的IL-6，IL-6是CD4＋T细胞分化的重要调节因子，能促进IL-4产生和抑制Th1分化，并在哮喘患者血清中高表达[26]。IL-4和IL-5在支气管粘膜中高表达，其中IL-5可诱导嗜酸性粒细胞的分化与激活，并将其募集到肺中，在募集过程中与Eotaxin具有协同作用，然后分泌大量的炎症细胞因子和趋化因子等促炎介质，在嗜酸性炎症中起重要作用[27]。用人源化抗IL-5抗体治疗嗜酸性哮喘患者后，可减少患者血液和痰中的嗜酸性粒细胞表达水平[28]。IL-4可刺激Th2细胞的分化，与IL-13一同促进B淋巴细胞向免疫球蛋白-e(IgE)转变，引起肥大细胞和嗜碱性细胞脱颗粒，释放组胺、白三烯、细胞因子和趋化因子等多种炎性介质，促进炎症和过敏疾病的发生[13，29]。本实验通过检测BALF中ILC2s相关的细胞因子，发现清热润燥口服液高低剂量可降低趋化因子Eotaxin和促炎因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-25、IL-33和TSLP在BALF中的含量(P<0.01)。通过免疫组化染色、流式细胞术和免疫双荧光染色结果，发现清热润燥口服液高低剂量可下调肺组织中IL-33及IL-5的表达(P<0.05，P<0.01)，减少哮喘小鼠肺组织中ILC2s的数量及生成(P<0.01)。提示该方对OVA致敏的哮喘小鼠的ILC2s数量和其相关细胞因子及IL-33和IL-5蛋白的表达有一定的调节作用。

综上所述，清热润燥口服液可能通过调节ILC2s细胞数量，及BALF中相关细胞因子的含量(趋化因子Eotaxin；上游细胞因子:IL-25、IL-33、TSLP；下游细胞因子:IL-4、IL-5、IL-6)和肺组织中IL-33和IL-5的表达来干预哮喘；提示该药可能通过降低ILC2s的数量及其相关的细胞因子含量和肺组织中IL-33和IL-5的表达来缓解哮喘小鼠的症状，但清热润燥口服液具体通过ILC2s细胞方面对哮喘疾病的影响有待进一步的研究。