基质胶在乳牙牙髓植入牙半空根管中的实验研究

汤小英 戴晓云 黄彦

牙髓再生治疗旨在通过细胞移植和细胞归巢两种方法来再生牙髓样组织[1-3]。前者需要外来移植干细胞、复杂的程序和高昂的成本，后者利用宿主的内源性细胞来实现组织修复或再生，更具临床可行性。目前临床运用较多的牙髓再生方法是牙髓血运重建术，其目的是通过严格的消毒控制炎症，刺激根尖引血以及严密的冠方封闭获得牙髓组织再生。但动物实验发现牙髓血运重建获得的更多是类似牙周组织的新生物，这样会造成牙根内钙化，再次感染后会造成治疗复杂化[4-5]。全牙髓存活可能规避牙髓血运重建获得的牙周组织新生物造成的治疗复杂化[6]。本团队前期研究将乳牙牙髓组织自体移植入年轻恒牙根管，结果显示植入根管内的乳牙牙髓组织保存活性，但移植牙髓成功的具体原因未知，既往研究发现血运重建可能是影响乳牙牙髓移植成功的重要影响因素[7]。基质胶(Matrigel)是一种可溶性的基底膜蛋白多糖基质，能够较好的模拟基底膜的各方面的特性，有助于培养内皮细胞形成互相连接的毛细血管样结构。为验证血运重建在乳牙牙髓移植中的作用，构建裸鼠异位模型，加入基质胶来促进血管生成。

1 材料与方法

实验方案包括照顾和使用实验动物，均经过了南昌大学伦理委员会批准。获取的牙齿以及牙髓，均获得了知情同意以及经过了南昌大学附属口腔医院伦理委员会批准。

1.1 主要试剂和仪器

超净工作(SW-CJ-1F，苏州净化)；移动涡轮机(FS15，浙江希安)； 石蜡切片机(沈阳百事通医疗有限公司)；普通光学显微镜(Olympus公司，日本 )；主要试剂： 三氧化物聚合体(MTA) (Dentsply公司，美国)；α-MEM培养基(Gibco，美国)； 多聚甲醛(赛驰生物)；三联抗生素(索莱宝科技公司)；磷酸盐缓冲液(PBS)(百奥莱博)；基质胶(Corning公司，美国)；抗CD31(Abcam，美国)。

1.2 实验牙和实验牙处理

实验牙选择：收集2019 年4～6 月在南昌大学附属口腔医院因正畸治疗而拔除的健康下颌前磨牙，年龄12～15 岁,收集了前磨牙36 颗。其中实验牙的纳入标准:单根管冠根完整无龋、不松动、根尖孔未发育完成、牙周健康、牙根长度大于12 mm。

半空管牙制备及分组：用手术刀片刮出牙根根面的牙周软组织，截去牙冠以及部分牙根，获得根尖孔大小为2 mm，长度为8 mm的牙根，牙根用PROTAPER®预备到35#06，预备过程中17%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液和5.25%次氯酸钠(NaClO)溶液交替冲洗，然后沿牙根中线破开牙根，一分为二。在室温下按顺序用 5.25%NaClO溶液超声振荡5 min，PBS 溶液超声振荡5 min，17%EDTA 溶液超声振荡15 min，最后用PBS溶液超声振荡5 min，随之使用去离子水震荡30 min，最后置入预备好的营养液中浸泡，用MTA封闭冠部，操作结束后立即转移至4 ℃恒温冰箱备用。半空管牙分为A、B、C 3 组，每组12 颗。

乳牙牙髓获得：收集2019 年7～8 月在南昌大学附属口腔医院因乳牙滞留的而拔除的健康的前牙24 颗。乳牙纳入实验的标准：冠部完整无龋、无明显松动、X线片显示牙根吸收未及1/3。用高速手机在乳牙牙体表面预备出一直线形的牙槽，从牙槽中间劈开乳牙，轻轻取出乳牙牙髓，立即置入预备好的营养液。

1.3 实验动物选择

6 周龄雌性裸鼠36 只，体重20～25 g(21.36±1.24)，由南昌乐悠生物科技有限公司提供，动物合格证号: SYXK(赣)2017-0002。

1.4 实验方法

A组：将获取的乳牙牙髓转移至超净台，对乳牙牙髓表面用α-MEM 培养基(混合三联抗生素液)进行冲洗，随之将解冻成液态的基质胶(Corning公司，美国)浸乳牙牙髓，搁置室温状态下形成胶冻状，将基质胶-牙髓复合体转移至牙空管中，与半空管牙一起植入裸鼠皮下；B组：乳牙牙髓处理同A组，但是不加入基质胶，直接将乳牙牙髓转移至半空管牙中，一起植入裸鼠皮下；C组：将备用的半空管牙根进行表面清洗，消毒后直接植入裸鼠皮下。

将所有处理好的裸鼠进行耳标标记。术后裸鼠仍置于南昌乐悠生物科技有限公司饲养，实验前后未进行特殊处理，饲养环境无改变。由于伤口缝合以及饲养过程中裸鼠意外死亡等原因导致样本缺少，在实验中随时补齐样本，保证每组的样本量恒定。确保每个样本在裸鼠皮下生活4 周。

1.5 术后操作、组织学及免疫组化分析

术后4 周后裸鼠脱颈处死，取出牙根，置入组织固定液中48 h，17%EDTA 进行脱钙，每24 h更换1 次脱矿液，3 月后待脱矿完成，切片，制成玻片。进行HE组织化学检查。A及B组标本进行双抗染色人源性CD31(servicebio、 GB21401)、鼠源性CD31(servicebio、 GB21403),最后DAPI(servicebio、G1012-100ML)复染细胞核。所有的结果都有两位检验科医师阅片。

牙髓存活判断标准：根管内HE染色可见血管以及细胞，人源性CD31染色阳性。

2 结 果

2.1 HE染色结果

A组牙根内含有裹有基质胶的乳牙牙髓，在HE染色中，有10 例牙根内可见成纤维细胞以及血管，成纤维细胞类似牙髓细胞，血管内可见血细胞(图 1A); B组：牙根内含有未裹有基质胶的乳牙牙髓，在HE染色中，有5例牙根内可见成纤维细胞以及血管，成纤维细胞类似牙髓细胞，血管内可见血细胞(图 1B)；C组：无牙髓放入，因此HE染色未见成纤维细胞或牙髓细胞，但是根管内均可见大量淋巴细胞,红细胞以及血管(图 1C)。

2.2 免疫组织化学染色结果

双抗染色合成图(图 2)显示，A组10 例样本中人源性CD31和鼠源性CD31抗体染色阳性；表明A组有10 例根管内牙髓组织为活性，活性组织内含有鼠来源血管供。B组5 例样本中人源性CD31和鼠源性CD31抗体染色阳性；表明B组有5 例根管内牙髓组织为活性，活性组织内含有鼠来源血管供。

2.3 乳牙牙髓存活数比较

见表 1。用SPSS 19.0统计软件进行卡方检验，P<0.05。

表 1 3 组移植中牙髓存活数(n)

图 1 半空根管内植入移植物后4 周后组织学观察 (HE， ×100)

图 2 半空根管内植入移植物后4 周后免疫荧光检测 (免疫荧光, ×100)

3 讨 论

本研究前期将比格犬的乳牙牙髓组织自体移植入牙髓坏死的年轻恒牙的根管中，发现植入乳牙牙髓后的根管壁持续增厚、牙根增长、根尖孔直径减小，这证明了乳牙牙髓组织自体移植的可实施性[6-7]。来源于乳牙牙髓的干细胞以及来自根尖周的干细胞甚至归巢的骨髓干细胞都可提供种子细胞，而牙髓组织本身可作为支架，牙髓组织内以及来自根尖血液均可提供生长因子[8-11]。但是牙髓移植成功的具体原因仍未知。血运重建是组织工程成功的关键，牙髓位于不可让的髓腔内，血管来源单一，通过根尖孔来源供应营养牙髓，因此血液供应影响牙髓移植的成功[12]。

基质胶是一种可溶性的基底膜蛋白多糖基质，基底膜蛋白多糖广泛存在于细胞膜表面和细胞基质中。其主要成分类似于哺乳动物的基底膜的生物活性基质，能够较好的模拟基底膜的各方面的特性[13-16]。与多种因子交互作用，从而参与机体的许多生理过程。研究发现原代培养的各种内皮细胞，在基质胶上6～12 h内均能形成互相连接的毛细血管样结构[17]。本研究将乳牙牙髓与基质胶相结合，一方面能够很好的将乳牙牙髓固定在SEC中，另一方面由于基质胶内含生长因子以及各种营养物质等，可保证乳牙牙髓营养供给，维持乳牙牙髓的活性。

牙本质组织经过消毒和处理后，可以暴露出新鲜的前期牙本质，而其中包含多种牙本质基质蛋白和细胞因子，被称为天然的诱导因子储备库[18-20]。既往研究证实牙本质片不仅具有与成牙本质细胞相匹配的孔径大小及孔隙率，而且可提供多种牙齿发育和再生所必需的重要因子，可以诱导种子细胞的黏附、增殖、分化，形成牙本质-牙髓复合体，因此根管腔具有独特的诱导微环境条件[21-22]。本研究采用根管腔为载体，HE染色可见有牙髓细胞，可能为来自本身乳牙牙髓细胞，也可能来自乳牙牙髓干细胞分化形成。实验未见形成牙本质-牙髓复合体，可能为观察时间不够，或者乳牙牙髓细胞的直径不能适应年轻恒牙牙本质小管直径。

本研究对牙进行半空管处理，当半空管牙放置于裸鼠皮下时，根管内有来自裸鼠组织的血细胞以及血管，这说明不仅基质胶促进血管生成，来自裸鼠的血液也一同保障乳牙牙髓的血液供应。

本实验进一步验证乳牙牙髓移植的可行性，乳牙牙髓组织内的干细胞发挥主要作用；通过SEC加大血运通路，基质胶促进血管新生增加血运，从而增加乳牙牙髓移植后活性。