咖啡酸衍生物WSY6对H2O2诱导的黑素细胞氧化损伤保护作用及潜在分子机制研究

陈小艳，惠 坤，马科党

(1.延安大学咸阳医院皮肤科，陕西 咸阳 712000；2.陕西省中医医院皮肤科，陕西 西安 710003)

白癜风是临床常见的一种自身免疫性疾病，其发病机制尚不明确，极难治愈，发病率较高，损坏患者容貌，对患者的自尊心造成极大的伤害，严重影响患者的生活质量[1-3]。目前研究显示[4-5]，白癜风发病的两个重要因素包括免疫反应和氧化应激反应，其中氧化应激损伤可引发黑素细胞损伤，已受到临床的广泛关注。抗氧化活性是表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)的一项重要功能，同时EGCG可保护肝脏、抗突变、抗癌的作用，且可避免抗氧化活性伤害肾细胞[6]。但EGCG脂溶性较差，生物利用度低，难以被皮肤吸收，对药物药效的发挥造成影响。咖啡酸衍生物WSY6是一种新的衍生物，李成檀等[7]通过的研究提示，咖啡酸及其衍生物是一类重要的多酚化合物，分布广泛，具有显著的调节免疫、抗氧化、抗炎症等作用。但目前临床关于咖啡酸衍生物WSY6是否具有抗氧化作用的相关报道较少。因此，本研究将探讨咖啡酸衍生物WSY6对H2O2诱导的黑素细胞氧化损伤的保护作用及潜在分子机制研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 我院泌尿外科健康人环切包皮人表皮黑素细胞，取材时已经本人同意且签订知情同意书。美国Sigma公司生产的异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)、二甲基亚砜(DMSO)、霍乱毒素；美国 Promega 公司生产的乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒、单溶液细胞增殖检测(MTS)试剂盒；美国Gibco公司生产的胎牛血清、链霉素、青霉素及F12培养基；上海碧云天生物技术有限公司生产的Western印迹上样缓冲液、活性氧(ROS)检测试剂盒；美国CST 公司生产的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化p38、caspase-9、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(caspase-3)、细胞色素 C(Cyto-C)、抗β肌动蛋白、p53(p-p53、p-ERK、p-p38、p-JNK)抗体等Western印迹实验所用抗体；美国 LI-COR公司生产的Odyssey 双色红外荧光成像系统；浙江大学药学院合成WSY6(纯度>95%)；美国MD公司生产的Spectra Max酶标仪；美国 BD 公司生产的Facsealibur 流式细胞仪。

1.2 人表皮黑素细胞培养及细胞毒性实验 将包皮壁沿虹膜剪下，设置温度为37 ℃，采用0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)及0.25%胰酶将剪下的包皮壁消化10 min；刮下的真皮上及角质层下的细胞采用立体显微镜下观察，以离心率为1000 r/min离心5 min，将沉淀细胞收集并置入HU16培养基中培养，设置温度为37 ℃，5%CO2培养后，接种至每孔1×104个细胞的96孔板，加入100 μl HU16培养液。培养12 h，细胞贴壁后将培养液吸弃，将 WSY6培养基(100、50、25、12.5、6.24、3.12、1.56、0.39、0 μmol/L)加入，培养1 d，将MTS 试剂加入，设置温度为37 ℃培养60 min，A490值采用酶标仪检测。每组设置3个复孔，上述实验连续3次。细胞存活率=[研究组(不同浓度WSY6组)A490值-空白组A490值]/(H2O2组A490值-空白组A490值)×100%。

1.3 细胞存活率测定 将对数生长期的黑素细胞(每孔1×104个)接种于96孔板中，将其设置为25、12.5、6.25 μmol/L WSY6组、H2O2组及空白组，分别将25、12.5、6.25 μmol/L WSY6预处理1 h，清洗后(Hu16培养基)，将1 mmol/L H2O2分别加入WSY6组和H2O2组培养1 h，清洗3次(Hu16培养基)，将培养基分别加入WSY6组、H2O2组及空白组，培养24 h。加入MTS，37 ℃孵育1 h，A490值采用酶标仪测定。每组复孔3个。计算细胞存活率。

1.4 黑素细胞LDH水平测定 将对数生长期的黑素细胞(每孔1×104个)接种于96孔板中，将其设置为25、12.5、6.25 μmol/L WSY6组、H2O2组及空白组，分别将25、12.5、6.25 μmol/L WSY6预处理1 h，清洗后(Hu16培养基)，培养1 d，对各组细胞培养上清液中LDH含量采用LDH试剂盒说明书测定，黑素细胞裂解液不做处理的LDH含量为100。将部分黑素细胞分为H2O2组和抑制剂组：先采用美国Selleck公司生产的SB203580 p38抑制剂对抑制组预处理1 h后，将1 mmol/L H2O2分别加入抑制剂组和H2O2组，清洗3次后(Hu16培养基)继续培养1 d，各组LDH释放量采用LDH试剂盒说明书测定，LDH释放量=[研究组(不同浓度WSY6组)上清液A490-空白上清液A490]/(抑制剂组A490-H2O2组A490)×100%。

1.5 黑素细胞ROS水平测定 在以3×105个为每孔细胞数6孔板内接种黑素细胞，细胞贴壁后，将黑素细胞分为WSY6 组、空白组、H2O2组，分别将25、12.5、6.25 μmol/L WSY6预处理1 h，清洗后(Hu16培养基)，其中WSY6组采用25 μmol/L WSY6预处理1、2、4 h，H2O2组和WSY6组细胞再用1 mmol/L H2O2处理1 h，采用培养基清洗，将1 ml 10 mmol/L 2，7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCF-DA)，设置温度为37 ℃，在黑暗中培养30 min,将PBS悬浮细胞加入，胞内ROS水平采用流式细胞仪测定。该实验需连续3次。

1.6 黑素细胞caspase-3、Cyto-C及caspase-9等蛋白水平采用Western印迹法测定 在每孔细胞数量为3×105个6孔板内接种黑素细胞，将对数生长期的黑素细胞(每孔1×104个)接种于96孔板中，将其设置为25、12.5、6.25 μmol/L WSY6组、H2O2组及空白组，分别将25、12.5、6.25 μmol/L WSY6预处理1 h，清洗后(Hu16培养基)，完成后，收集裂解细胞，提取裂解细胞蛋白，电泳，转入蛋白，5%脱脂奶粉，室温封闭1 h，将一抗(兔抗人Cyto-C、p-ERK、p-p38、caspase-9、p-p53、caspase-3抗体、p-NK抗体及鼠抗人β肌动蛋白)，设置温度为4 ℃孵育12 h，洗膜后，将山羊抗兔IgG抗体加入，孵育1 h后，扫描分析。以上实验为确保准确性均需连续3次。

2 结 果

2.1 0.39～50 μmol/L WSY6对黑素细胞存活率的影响 1 d后，0.39～50 μmol/L WSY6组细胞存活率与空白组比较，差异没有统计学意义(F=1.892，P>0.05)；加入100 μmol/L WSY6后细胞存活率与空白组比较显著降低(t=15.588，P=0.004)，见表1。

表1 0.39～50 μmol/L WSY6对黑素细胞存活率的影响

2.2 不同浓度WSY6对氧化应激下黑素细胞活性的影响 WSY6组细胞明显优于H2O2组(图1)。H2O2组细胞存活性明显低于空白组，而0.39～50 μmol/L WSY6预处理后，细胞存活率明显高于H2O2组，且浓度越高细胞存活率越高，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度WSY6对黑素细胞存活率的影响

A：空白组，黑素细胞呈树枝状，树枝连成网状；B:H2O2组，细胞贴壁数量减少，树突状消失；C:12.5 μmol/L WSY6组，贴壁细胞增多，树突无改变；D:为25 μmol/L WSY6组，增多的贴壁细胞，细胞状态良好

2.3 不同浓度WSY6对黑素细胞LDH释放量的影响 6.25～25 μmol/L WSY6细胞LDH释放量均较空白组显著升高，而较H2O2组均显著降低(P<0.05)，且WSY6浓度越低则降低越明显(r=-0.949，P<0.01)。p38抑制剂组和H2O2组黑素细胞LDH释放量比较差异不具有统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 不同浓度WSY6对黑素细胞LDH释放量的影响

2.4 黑素细胞ROS水平受WSY6的影响 将空白组细胞内ROS水平设定为1，对25 μmol/L WSY6预处理1、2和4 h后，细胞内ROS水平分别为7.61±0.87、6.32±0.32、5.21±0.32，H2O2组黑素细胞内ROS水平上升至18.42±1.63，不同时间处理25 μmol/L WSY6与H2O2组比较均显著降低(P<0.05)。黑素细胞内ROS含量随WSY6预处理时间越长而越低(r=-0.892，P<0.05)。

2.5 黑素细胞凋亡相关蛋白表达受WSY6的影响 黑素细胞仅少量表达caspase-3、Cyto-C及caspase-9采用H2O2处理，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表达含量均明显升高，但经WSY6分别对caspase-3、Cyto-C及caspase-9处理后，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表达均降低(图2)。p-p38、p-ERK和p-JNK均采用H2O2对处理后，其表达水平均高于空白组(图3)；对WSY6预处理后，H2O2WSY6浓度明显低于p-p38的表达，H2O2WSY6浓度越低则H2O2WSY6表达越低，而p-JNK、p-ERK的表达无改变；而WSY6浓度升高后p38 MAPK下游产物p-p53的表达则降低。联合WSY6或单独H2O2处理JNK、ERK及p38总蛋白水平均无明显变化。

1：空白组；2：H2O2组；3～5：16.25、12.5、25μmol/L WSY6组

图3 p-p38、p-ERK和p-JNK均采用H2O2对处理后表达变化情况

3 讨 论

白癜风是一种常见的由表皮黑素细胞破坏造成的色素脱失性疾病。该病发病机制尚不清除，但与氧化应激、神经精神、免疫、遗传、功能性黑素细胞凋亡和丢失等相关。目前氧化应激学说已成为临床研究的热点及重点。赵晓菲等[8]通过的研究证实，氧化应激机制在白癜风中发挥重要作用，且与病情活动程度相关。咖啡酸衍生物是茶叶、咖啡、水果、蔬菜等植物中存在的常见形式，属于中性酚类化合物，已有相关研究证实[9-11]，经合成的咖啡酸酰胺可作为有效的抗氧化剂，而咖啡酸衍生物WSY6是一种新的衍生物，不仅具有较强的抗氧化作用，而且具有较强的抗菌活性。但咖啡酸衍生物WSY6是否对H2O2诱导的黑素细胞氧化损伤具有保护作用及其机制的相关研究较少[12-14]。基于此，本研究探讨咖啡酸衍生物WSY6对H2O2诱导的黑素细胞氧化损伤的保护作用及潜在分子机制研究，以提高治疗效果，改善患者生活质量，为白癜风患者的治疗提供新思路，对临床白癜风患者的治疗具有重要意义及价值。

本研究结果显示，采用100 μmol/L WSY6后，细胞存活率为(91.0±1.0)%，与空白组比较(P<0.05)，提示咖啡酸衍生物WSY6浓度越高，细胞存活率越高，细胞存活率与咖啡酸衍生物WSY6浓度密切相关。在白癜风活动期皮损中过氧化氢酶水平降低，H2O2浓度可达到毫摩尔浓度，在黑素细胞自毁学说中氧化应激被认为是导致白癜风患者表皮黑素细胞消失的始动因素[15-17]。因此，本研究设置H2O2组，以观察咖啡酸衍生物WSY6对黑素细胞的影响情况。本研究结果显示，WSY6组细胞明显优于H2O2组，保护效果随浓度升高而越好；H2O2组细胞存活性明显低于空白组，而不同浓度WSY6预处理后，细胞存活率明显高于H2O2组，且浓度越高细胞存活率越高(P<0.05)，提示咖啡酸衍生物WSY6细胞存活率明显优于H2O2，且浓度越高，存活率越高。另外本研究对不同浓度WSY6对黑素细胞LDH释放量的影响进行研究，结果显示，H2O2处理后， 0.39～50 μmol/L WSY6细胞LDH释放量均高于空白组(P<0.05)； 0.39～50 μmol/L WSY6预处理1 h后，不同浓度组LDH释放量均低于H2O2组(P<0.05)，且WSY6浓度越低则降低越明显(P<0.01)，提示咖啡酸衍生物WSY6抗黑素细胞氧化作用较好，对细胞内LDH释放量具有明显的降低作用。

Schallreute等[18]通过的研究提示，白癜风患者皮损部位存在H2O2，且可导致H2O2积累，其暴露会诱发黑素细胞胞内ROS水平增加，增加潜在的细胞毒性，损伤细胞或导致细胞凋亡。故治疗白癜风的一种有效手段是采用抗氧化剂去除ROS。本研究结果显示，不同时间处理25 μmol/L WSY6与H2O2组比较(均P<0.05)；对WSY6预处理时间越长，黑素细胞内ROS含量则越低(均P<0.05)，提示采用H2O2处理黑素细胞后，细胞内ROS水平增加，给予WSY6预处理后，可明显降低黑素细胞内ROS水平，且随着处理时间的延长，黑素细胞内ROS含量则越低。

Mastore等[19]通过的研究提示，JNK、ERK1/2、p38 MAPK等MAPK家族成员在细胞黑素生成中发挥重要作用。Giovannelli等[20]通过的研究则提示，ROS堆积异常会刺激MAPK旁路，进而影响基因表达，造成炎症反应和细胞凋亡。本研究结果显示，黑素细胞仅少量表达caspase-3、Cyto-C及caspase-9，采用H2O2处理，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表达含量均明显升高，但经WSY6分别对caspase-3、Cyto-C及caspase-9处理后，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表达均降低；p-p38、p-ERK和p-JNK均采用H2O2处理后，其表达水平均高于空白组；对WSY6预处理后，H2O2WSY6浓度明显低于p-p38的表达，H2O2WSY6浓度越低则H2O2WSY6表达越低，而p-JNK、p-ERK的表达无改变；而WSY6浓度升高后p38 MAPK下游产物p-p53的表达则降低，提示H2O2对黑素细胞JNK、ERK及p38 MAPK具有刺激作用，但WSY6预处理具有抑制H2O2介导的p38磷酸化。故在H2O2介导的黑素细胞凋亡中激活p38 MAPK可起到重要作用，而WSY6对黑素细胞的保护作用主要通过抑制p38 MAPK的活性发挥。

综上所述，WSY6减弱H2O2介导的黑素细胞氧化应激损伤和凋亡，主要通过下调细胞ROS水平，对Cyto-C表达和p38 MAPK活性具有抑制作用，提示WSY6可为白癜风的治疗提供新思路。